MÉTODOS DE ENSAYO DE FOTOTOXICIDAD Y ALTERNATIVAS EN ANIMALES
Es esencial garantizar la fotoseguridad de los productos químicos cuando hay posibilidades de exposición humana, como pueden ejemplificar claramente los productos farmacéuticos (20) o los cosméticos (21). Para evaluar el potencial de fototoxicidad de una sustancia química, se han introducido varios métodos de ensayo que van desde ensayos in silico(22), in chemico(23), in vitro a in vivo. En ensayos químicos como la generación ROS (24), se han desarrollado y utilizado de forma rutinaria ensayos in vitro que incluyen el ensayo 3T3 NRU y el modelo de epidermis 3D, y estudios in vivo en los que se emplearon cobayas, ratones o ratas pigmentadas (25).
Fuente de luz para fototoxicidad. La fuente luminosa de fototoxicidad es extremadamente importante, ya que las longitudes de onda absorbidas por la sustancia problema (espectro de absorción) y la dosis de luz (alcanzable en un tiempo de exposición razonable) deben ser suficientes para inducir fototoxicidad (26). Los simuladores solares que simulan la luz solar natural se consideran la fuente de luz artificial ideal (Fig. 5).
La distribución de energía de irradiación del simulador solar filtrado debe ser similar a la de la luz diurna al aire libre. Los simuladores solares están equipados con arcos de xenón o arcos de haluro metálico de mercurio (dopados). También deben filtrarse adecuadamente para atenuar las longitudes de onda UVB altamente citotóxicas. El espectro registrado debajo de estos filtros no debe desviarse de la luz diurna estandarizada para exteriores (Especificación: FDA CFR Parte 201.327, ISO 24444:2010(e), CIE-85-1989).
Sin embargo, otras fuentes de luz UVA como la lámpara UVA también se pueden usar con un dosímetro UV adecuado para verificar la intensidad y la longitud de onda. La intensidad de la luz (irradiación) varía en función de las fuentes, y debe comprobarse periódicamente antes de cada prueba de fototoxicidad utilizando un medidor de rayos UV de banda ancha adecuado. El medidor de rayos UV debe haberse calibrado antes de cada medición. En consecuencia, el tiempo de irradiación depende de la intensidad de la fuente de luz (por ejemplo, para una fuente de luz de 1,7 mW/cm2, se necesita un tiempo de exposición de 50 minutos para alcanzar 5 J/cm2). El tiempo de irradiación también varía según los métodos de prueba. Se determinó que una dosis de 5 J/cm2 (medida en el rango UVA) no era citotóxica pero era lo suficientemente potente como para excitar sustancias químicas y provocar reacciones fototóxicas en el ensayo de captación de rojo neutro 3T3.
Ensayo de captación de rojo neutro 3T3. El ensayo 3T3 NRU ha sido aprobado oficialmente por la OCDE y aprobado como TG432 de la OCDE el 13 de abril de 2004 (3). Este ensayo evalúa la fotocitotoxicidad determinando la reducción relativa de la viabilidad celular después de la exposición al artículo de ensayo en presencia o ausencia de irradiación UV/VIS. Se está tomando la decisión de realizar el ensayo de fototoxicidad 3T3 NRU para las sustancias que muestran espectros de absorción en la región UV/VIS cuando se disuelven en el disolvente apropiado (17). Se ha sugerido que si el coeficiente de extinción/absorción molar es inferior a 10 litros x mol−1 x cm−1, es poco probable que el producto químico sea fotorreactivo (por ejemplo, en cubeta UV con trayectoria luminosa de 1 cm de largo, la DO de solución de 0,05 M será inferior a 0,5 para que se considere no fotorreactiva sobre la base de la ecuación «absorbancia = coeficiente de extinción x longitud de trayectoria x concentración») (26). La prueba de NRU 3T3 muestra una capacidad predictiva específica altamente sensible pero baja (una sensibilidad del 93% y una especificidad del 84%). La prueba de NRU 3T3 tiene muchas limitaciones. No puede predecir efectos adversos distintos de la fototoxicidad(citotoxicidad)que pueden surgir de la acción combinada de una sustancia química y la luz, como la fotogenotoxicidad, la fotoalergia(fotosensibilización) o la fotocarcinogenicidad. La prueba de la 3T3 NRU solo se utiliza para la identificación de peligros, mientras que su utilidad para la evaluación de la potencia fototóxica no está justificada.En particular, este sistema de ensayo carece de actividad metabólica, que es crítica en la manifestación de sustancias químicas expuestas sistémicamente. Por lo tanto, para sustancias químicas expuestas sistémicamente que requieren activación metabólica como la monocrotalina, la riddelicina y la heliotrina (alcaloides de pirrolizidina) (28), se recomiendan estudios in vivo en animales (5,29).
El principio de prueba fundamental de 3T3 NRU es la comparación de la viabilidad celular en presencia o ausencia de irradiación UV/Vis determinada con un tinte vital, rojo neutro, que es un tinte catiónico débil que penetra fácilmente en las membranas celulares y se acumula intracelularmente en lisosomas de células viables. La línea celular base es la célula Balb / c 3T3, que es un fibroblasto de ratón desarrollado a partir de embriones de ratón por G. T. Todaro en 1968. La designación 3T3 significa «transferencia de 3 días, células de inóculo 3 × 105» en plato de 20 cm2, y esta celda es relativamente estable, fácilmente disponible y fácil de manejar (30). El fibroblasto dérmico es una de las células diana de fototoxicidad que proporciona una sólida justificación para el empleo de células 3T3.
Para decidir si el artículo de ensayo es fototóxico o no en el ensayo 3T3 NRU, la concentración-respuesta se obtendrá en presencia y en ausencia de irradiación. Se calculará el Factor de Fotoirritación (FIP) o el Fotoefecto Medio (PME) (31). PIF es la relación de CI50 (concentración que disminuye la viabilidad celular en un 50%) de no irradiado sobre irradiado, como se muestra en la Fig. 7.
Cuando no se puede obtener el CI50, el EMP se calcula como la siguiente ecuación
PIF < 2 o un MPE < 0.1 predice: «sin fototoxicidad». Un PIF > 2 y < 5 o un MPE > 0,1 y < 0.15 predice: «probable fototoxicidad» y PIF > 5 o un MPE > 0.15 predice: «fototoxicidad» (Fig. 8).
Prueba de hemólisis de eritrocitos. Las membranas celulares son vulnerables a ROS y radicales generados fotoquímicamente. Los daños inducidos por los rayos UVA de los eritrocitos y la hemólisis resultante (fotohemólisis)se capitalizan para evaluar el potencial fototóxico de los artículos de prueba (32). Los glóbulos rojos de oveja (SRBC) se incuban con productos químicos e irradian con UVA a 20 J/cm2. Después de la irradiación, los SRBC se incubaron en la oscuridad durante 2 horas a temperatura ambiente y luego durante 1 hora adicional a 37℃, después de lo cual se midió la hemólisis con el reactivo de Drabkin y la medición de la absorbancia UV a 540 nm. El grado de fototoxicidad se evaluó mediante la liberación de hemoglobina de SRBC, es decir, la actividad fotohemolítica, como se indica en la ecuación (33).
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ADE: densidad óptica de la solución farmacológica expuesta con eritrocitos
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AD: densidad óptica de la solución farmacológica expuesta sin eritrocitos
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C: densidad óptica de solución de control hemolítico al 100%
Los fototoxicantes como ciprofloxacino, norfloxacino o enoxacino aumentan significativamente la actividad fotohemolítica más allá del 20% a 100 µg/ml. La sensibilidad, especificidad y precisión de esta prueba fueron del 67%, 73% y 73%, respectivamente, para 24 productos químicos (8 fragancias, 5 absorbentes de rayos UV, 4 medicamentos, 4 antimicrobianos y 3 tintes) en comparación con la prueba in vivo con cobayas (34). La baja sensibilidad puede ser problemática y su rendimiento es muy inferior al de la prueba 3T3 NRU, lo que puede explicar la disminución del uso de esta prueba recientemente.
Modelo de epidermis humana 3D in vitro. Para superar las limitaciones de los métodos basados en células in vitro, se está investigando el modelo de epidermis reconstruido en 3D para su aplicación a pruebas de fototoxicidad (35,36). Básicamente, el principio de la prueba es similar al de la prueba 3T3 NRU, es decir, la evaluación de la diferencia de viabilidad tisular entre la presencia y la ausencia de irradiación UV/VIS. Se puede utilizar un modelo de predicción similar que utilice PIF y MPE (37). En el modelo de epidermis 3D, sin embargo, se pueden probar materiales insolubles en agua y se conserva una cierta capacidad metabólica en los queratinocitos primarios en la capa epidérmica que se puede aplicar a los tóxicos que requieren activación metabólica (38). Además, es posible medir la producción de citoquinas como IL-1β (Interleucina-1β) (39), el ensayo de cometas (40) y el examen histológico que se puede considerar en la evaluación adicional de la fotoalergenicidad y la fotocarcinogenicidad.
Métodos in vivo que emplean cobayas, ratones o ratas pigmentadas. Se están empleando animales de laboratorio como ratones y cobayas para simular escenarios de fototoxicidad humana en la vida real. Los animales están expuestos a sustancias químicas por vía tópica o sistémica e irradiados con una dosis adecuada de UVA (generalmente 10 J/cm2 para la prueba con cobayas, 20 J/cm2 para la prueba con ratones (41)). Se suma la puntuación de eritema y edema de 0 a 4 y se promedia la puntuación máxima durante 72 horas de observación por animal para generar el índice de irritación. El índice de fototoxicidad se obtiene mediante la ecuación «Índice de irritación del sitio irradiado por rayos UVA-Índice de Irritación del sitio no irradiado» (42). El índice de fototoxicidad superior a 0,6 indica el potencial de fototoxicidad. Alternativamente, se puede medir el grosor de la oreja para estimar el edema en pruebas de ratón. Estas pruebas in vivo reflejan bien el proceso fisiopatológico de la fototoxicidad en humanos, pero los sacrificios de animales, los gastos y el tiempo necesarios para llevar a cabo la prueba plantean muchos problemas, especialmente en la era de la conciencia generalizada sobre el bienestar y la ética de los animales. Las pruebas de fototoxicidad no basadas en animales están ganando popularidad en estos días para superar estos problemas (43).
En métodos químicos para la evaluación de la fototoxicidad. Se han estudiado métodos de probeta sin células, concretamente en química, para evaluar la fototoxicidad. Se ha analizado la información sobre la absorción de la luz y la fotoestabilidad del artículo de prueba para predecir la fototoxicidad (44). Empleando la generación de especies reactivas de oxígeno durante la fotoexcitación y la posterior fotorreacción, se puede evaluar el potencial fototóxico de una sustancia química en chemico (12). El oxígeno singlete se detecta mediante blanqueo de p-nitrosodimetilanilina (RNO), mientras que la prueba de tetrazolio de azul nitroso (reacción de NBT-formazan) se emplea para determinar la generación de peróxido como se muestra a continuación (24),
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Oxígeno singlete + imidazol
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→ → imidazol oxidado
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+ RNO
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→ Blanqueamiento RNO + productos
El ensayo de generación de ROS mostró una sensibilidad y especificidad de 90% y 76,9% para cosméticos y de 100% y 75% para productos químicos no cosméticos. La actividad de ruptura de cadenas de ADN es otra forma de evaluar la fototoxicidad inducida por rayos UV de diferentes tipos de productos químicos, o fármacos en química, a través de la cuantificación del ADN circular abierto o cerrado. Este ensayo tampoco requiere células o tejidos vivos, sino plásmido. El plásmido se disuelve en tampón y se mezcla con artículos de prueba. Una vez que la mezcla ha sido irradiada con rayos UV, las muestras se someten a electroforesis. La cantidad de ADN roto se analiza mediante tecnología basada en fluorescentes. El compuesto fototóxico inducido por rayos UV abre las hebras de ADN y depende de la concentración del fármaco y de la dosis de irradiación UV (33). Estas pruebas no requieren células ni tejidos vivos que puedan aumentar la variabilidad de los resultados de las pruebas. Sin embargo, estos métodos tienen limitaciones que incluyen la falta de capacidad de activación metabólica, la inaplicabilidad de materiales insolubles en agua (aceites, sólidos, geles, productos formulados) y la incapacidad de predecir la fotogenotoxicidad, la fotoalergia(fotosensibilización) o la fotocarcinogenicidad. Este ensayo se limita a la identificación del peligro, no a la evaluación de la potencia fototóxica.