fototoxicitási vizsgálati módszerek és állati alternatívák
alapvető fontosságú a vegyi anyagok fotobiztonságának biztosítása olyan esetekben, amikor fennáll az emberi expozíció esélye, amint azt a gyógyszerek (20) vagy a kozmetikumok (21) egyértelműen példázzák. Egy vegyi anyag fototoxicitási potenciáljának értékelésére különféle vizsgálati módszereket vezettek be, amelyek az in silico(22), a chemico(23), Az in vitro és az in vivo vizsgálat között mozognak. Az olyan kemikáliás vizsgálatokban, mint a ROS generáció (24), a 3T3 NRU vizsgálatot és a 3D epidermisz modellt tartalmazó in vitro vizsgálatot, valamint tengerimalacot, egeret vagy pigmentált patkányt alkalmazó in vivo vizsgálatokat fejlesztettek ki és rutinszerűen alkalmaztak (25).
fényforrás a fototoxicitáshoz. A fényforrás a fototoxicitás szempontjából rendkívül fontos, mivel a vizsgált vegyi anyag által elnyelt hullámhossznak (abszorpciós spektrum) és a (ésszerű expozíciós idő alatt elérhető) fénydózisnak elegendőnek kell lennie a fototoxicitás kiváltásához (26). A természetes napfényt szimuláló napelemes szimulátorokat ideális mesterséges fényforrásnak tekintik (ábra. 5).
a szűrt napszimulátor besugárzási teljesítményeloszlásának közel kell lennie a kültéri nappali fényhez. A napelemes szimulátorok xenon ívekkel vagy (adalékolt) higany-fémhalogenid ívekkel vannak felszerelve. Ezeket is megfelelően szűrni kell, hogy enyhítsék az erősen citotoxikus UVB hullámhosszokat. Az ezen szűrők alatt rögzített spektrum nem térhet el a szabványosított kültéri napfénytől(specifikáció: FDA CFR Part 201.327, ISO 24444:2010 (E), CIE-85-1989).
Mindazonáltal más UVA fényforrás, mint az UVA lámpa is használható megfelelő UV dózismérővel az intenzitás és a hullámhossz ellenőrzésére. A fény intenzitása (besugárzás) a forrásoktól függően változik, ezért minden fototoxicitási vizsgálat előtt rendszeresen ellenőrizni kell egy megfelelő széles sávú UV-mérővel. Az UV-mérőt minden mérés előtt kalibrálni kell. Ennek megfelelően a besugárzási idő a fényforrás intenzitásától függ (például 1,7 mW/cm2 fényforrás esetén 50 perc expozíciós idő szükséges az 5 J/cm2 eléréséhez). A besugárzási idő a vizsgálati módszerektől függően is változik. Az 5 J/cm2 dózis (az UVA tartományban mérve) nem citotoxikus, de kellően hatékony ahhoz, hogy a 3T3 semleges vörös felvételi vizsgálatban fototoxikus reakciókat váltson ki.
3T3 semleges vörös felvételi vizsgálat. 3T3 NRU assay hivatalosan jóváhagyta az OECD és jóváhagyta az OECD tg432 április 13-án 2004 (3). Ez a vizsgálat a fotocitotoxicitást úgy értékeli, hogy meghatározza a sejt életképességének relatív csökkenését a vizsgálati cikknek való kitettség után UV/VIS besugárzás jelenlétében és hiányában. Döntés a 3T3 NRU fototoxicitási vizsgálat elvégzéséről azon vegyi anyagok esetében, amelyek megfelelő oldószerben oldva UV/VIS tartományban abszorpciós spektrumot mutatnak (17). Azt javasolták, hogy ha a moláris kioltási/abszorpciós együttható kisebb, mint 10 liter x mol−1 x cm−1, akkor a vegyi anyag valószínűleg nem fotoreaktív (pl. 1 cm hosszú fényútú UV küvettában a 0,05 M od oldat kisebb, mint 0,5, hogy nem fotoreaktívnak lehessen tekinteni az “abszorbancia = kioltási együttható x úthossz x koncentráció” egyenlet alapján) (26). A 3T3 NRU teszt rendkívül érzékeny, de alacsony specifikus prediktív kapacitást mutat (93% – os érzékenység és 84% – os specificitás). A 3T3 NRU tesztnek számos korlátja van. Nem képes előre jelezni a vegyi anyag és a fény együttes hatásából eredő fototoxicitáson(cito)kívüli egyéb káros hatásokat, mint például fotogenotoxicitás, fotoallergia(fotoszenzitizáció) vagy fotokarcinogenitás. A 3T3 NRU tesztet csak veszélyazonosításra alkalmazzák, míg hasznossága a fototoxikus hatás értékelése szempontjából nem indokolt.Különösen ennek a vizsgálati rendszernek nincs metabolikus aktivitása, amely kritikus a szisztémásan kitett vegyi anyagok megnyilvánulásában. Ezért a szisztémásan kitett vegyi anyagok esetében, amelyek metabolikus aktiválást igényelnek, mint például a monokrotalin, a riddellin és a heliotrin (pirrolizidin alkaloidok) (28), in vivo állatkísérletek ajánlottak (5,29).
a 3T3 NRU alapvető vizsgálati elve a sejtek életképességének összehasonlítása UV/Vis besugárzás jelenlétében vagy hiányában, a semleges vörös létfontosságú festékkel meghatározva, amely gyenge kationos festék, amely könnyen behatol a sejtmembránokba és intracellulárisan felhalmozódik az életképes sejtek lizoszómáiban. Az alapsejtvonal a Balb / c 3T3 sejt, amely egér fibroblaszt egér embriókból fejlesztette ki G. T. Todaro 1968-ban. A 3T3 megnevezés a “3 napos transzfer, inokulum 3-105 sejt” kifejezést jelenti 20 cm2-es edényben, és ez a sejt viszonylag stabil, könnyen hozzáférhető és könnyen kezelhető (30). A dermális fibroblaszt a fototoxicitás egyik célsejtje, amely szilárd alapot nyújt a 3T3 sejtek foglalkoztatásához.
annak eldöntéséhez, hogy a vizsgálati cikk fototoxikus-e vagy sem a 3T3 NRU vizsgálatban, a koncentráció-választ besugárzás jelenlétében és annak hiányában kell meghatározni. Ki kell számítani a fotoirritációs tényezőt (PIF) vagy az átlagos fotóhatást (MPE) (31). PIF az arány IC50 (koncentráció, amely csökkenti a sejt életképességét 50%) a nem besugárzott felett besugárzott ábrán látható módon. 7.
ha az IC50 nem érhető el, az MPE-t a
PIF < 2 vagy MPE < 0.1 jósolja: “nincs fototoxicitás”. A PIF > 2 és < 5 vagy a legnagyobb megengedett hiba > 0,1 és < 0,15 a következőket jósolja: “valószínű fototoxicitás” és PIF > 5 vagy legnagyobb hiba > 0,15 a következőket jósolja: “fototoxicitás” (ábra. 8).
eritrocita hemolízis teszt. A sejtmembránok érzékenyek a fotokémiailag generált ROS-ra és gyökökre. Az eritrocita UVA-indukálta károsodását és az ebből eredő hemolízist (fotohemolízist)nagybetűvel írják a vizsgálati cikkek fototoxikus potenciáljának felmérésére (32). A juhvörösvérsejteket (SRBC) vegyszerekkel inkubáljuk, és 20 J/cm2-nél uva-val besugározzuk. A besugárzást követően az Srbc-ket szobahőmérsékleten 2 órán át, majd további 1 órán át inkubáltuk sötétben, 37 db-On, ezt követően a hemolízist Drabkin-reagenssel mértük, az UV-abszorbanciát pedig 540 nm-en. A fototoxicitás mértékét az SRBC-ből származó hemoglobin felszabadulásával, azaz fotohemolitikus aktivitással értékeltük a (33) egyenlet szerint.
-
ADE: a kitett gyógyszeroldat optikai sűrűsége eritrocitákkal
-
AD: a kitett gyógyszeroldat optikai sűrűsége eritrociták nélkül
-
C: 100% – os hemolitikus kontroll oldat optikai sűrűsége
az olyan Fototoxikánsok, mint a ciprofloxacin, a norfloxacin vagy az enoxacin, jelentősen növelik a fotohemolitikus aktivitást 20% – nál nagyobb mértékben, 100 KB/mL-nél. A vizsgálat érzékenysége, specifitása és pontossága 67%, 73% és 73% volt 24 vegyi anyag esetében (8 illatanyag, 5 UV-abszorbens, 4 gyógyszer, 4 antimikrobiális szer és 3 festék), összehasonlítva az in vivo tengerimalac-teszttel (34). Az alacsony érzékenység problematikus lehet, teljesítménye pedig jóval alacsonyabb, mint a 3T3 NRU teszté, ami magyarázhatja a teszt használatának csökkenését az utóbbi időben.
In vitro humán 3D epidermisz modell. Az in vitro sejtalapú módszerek korlátainak leküzdése érdekében 3D rekonstruált epidermisz modellt vizsgálnak a fototoxicitási vizsgálatokhoz (35,36). Alapvetően a vizsgálati elv hasonló a 3T3 NRU teszthez, nevezetesen az UV/VIS besugárzás jelenléte és hiánya közötti szöveti életképesség különbségének értékeléséhez. Hasonló, PIF-et és MPE-t alkalmazó előrejelzési modell alkalmazható (37). A 3D epidermisz modellben azonban vízben oldhatatlan anyagok vizsgálhatók, és az epidermális réteg primer keratinocitáiban bizonyos mértékű metabolikus kapacitás megmarad, amely a metabolikus aktiválást igénylő toxikus anyagokra alkalmazható (38). Emellett lehetséges a citokin termelés mérése, mint például az IL-1 (Interleukin-1) (39), a comet-vizsgálat (40) és a szövettani vizsgálat, amelyek figyelembe vehetők a fotoallergenitás és a fotokarcinogenitás további értékelésében.
in vivo módszerek tengerimalac, egér vagy pigmentált patkány alkalmazásával. Laboratóriumi állatokat, például egereket és tengerimalacokat alkalmaznak az emberi fototoxicitás valós forgatókönyvének szimulálására. Az állatokat helyileg vagy szisztémásan vegyi anyagoknak teszik ki, és megfelelő adag UVA-val besugározzák (általában 10 J/cm2 a tengerimalac-vizsgálathoz, 20 J/cm2 az egér-vizsgálathoz (41)). Az erythema és az ödéma pontozása 0-tól 4-ig összegezhető, és a maximális pontszámot 72 óra megfigyelés alatt állatonként átlagolják, hogy irritációs indexet generáljanak. A fototoxicitási indexet az “UVA-besugárzott – nem besugárzott hely irritációs indexe” (42) egyenletből kapjuk. A 0,6 feletti fototoxicitási index a fototoxicitás potenciálját jelzi. Alternatív megoldásként a fülvastagság mérhető az ödéma becsléséhez egér tesztekben. Ezek az in vivo vizsgálatok jól tükrözik az emberi fototoxicitás patofiziológiai folyamatát, de az állatok feláldozása, a vizsgálat elvégzéséhez szükséges költségek és idő sok problémát vet fel, különösen az állatjólét és az etika széles körű tudatosságának korában. A nem állati alapú fototoxicitási tesztek manapság egyre népszerűbbek e problémák leküzdése érdekében (43).
a fototoxicitás értékelésének kémiai módszereiben. A fototoxicitás értékelésére sejtmentes kémcsöves módszereket fedeztek fel, nevezetesen a chemico-ban. A vizsgálati cikk fényelnyelésére és fotostabilitására vonatkozó információkat elemezték a fototoxicitás előrejelzésére (44). A fotoexcitáció és az azt követő fotoreakció során reaktív oxigénfajok képződését alkalmazva egy vegyi anyag fototoxikus potenciálja értékelhető a chemico-ban(12). A szingulett oxigént p-nitrozodimetil-anilin (RNO) fehérítéssel detektáljuk, míg a Nitrokék-Tetrazolium tesztet (NBT-formazán reakció) alkalmazzuk a peroxid képződésének meghatározására az alábbiak szerint(24),
-
Singlet oxigén + imidazol
-
→ → oxidált imidazol
-
+ RNO
-
→ RNO fehérítő + termékek
a ROS generációs vizsgálat a kozmetikumok esetében 90%-os és 76,9% – os, a nem kozmetikai vegyi anyagok esetében pedig 100% – os és 75% – os érzékenységet és specificitást mutatott. A DNS-szál törési aktivitása egy másik módszer a különféle vegyi anyagok UV-indukált fototoxicitásának értékelésére, vagy gyógyszerek a chemico-ban a nyitott vagy zárt kör alakú DNS számszerűsítésével. Ez a vizsgálat nem igényel élő sejteket vagy szöveteket, hanem plazmidot. A plazmidot pufferben oldják, és vizsgálati tárgyakkal keverik. Miután a keveréket UV-vel besugároztuk, a mintákat elektroforézisnek vetjük alá. A törés DNS mennyiségét fluoreszcens alapú technológiával elemezzük. Az UV-indukált fototoxikus vegyület DNS-szálak megnyitását eredményezi, és ez függ a gyógyszer koncentrációjától és az UV besugárzási dózistól (33). Ezek a vizsgálatok nem igényelnek élő sejteket vagy szöveteket, amelyek növelhetik a vizsgálati eredmények változékonyságát. Ezeknek a módszereknek azonban vannak korlátai, amelyek magukban foglalják a metabolikus aktivációs képesség hiányát, a vízben oldhatatlan anyagok (olajok, szilárd anyagok, gélek, formulázott termékek) alkalmazhatatlanságát, valamint a fotogenotoxicitás, a fotoallergia(fényérzékenység) vagy a fotokarcinogenitás előrejelzésének képtelenségét. Ez a vizsgálat a veszély azonosítására korlátozódik, nem pedig a fototoxikus hatás értékelésére.