testmethoden voor fototoxiciteit en dierlijke alternatieven
het is van essentieel belang de fotosafety van chemische stoffen te waarborgen wanneer er kans is op blootstelling van de mens, zoals duidelijk kan worden geïllustreerd door geneesmiddelen (20) of cosmetica (21). Om het potentieel van fototoxiciteit van een chemische stof te evalueren, zijn verschillende testmethoden geïntroduceerd die variëren van In silico(22), in chemico(23), in vitro tot in vivo assay. In chemicotests zoals Ros-generatie (24) zijn in-vitro-tests met 3T3 NRU-test en 3D-epidermismodel en in-vivo-onderzoeken met cavia ‘ s, muizen of gepigmenteerde ratten ontwikkeld en routinematig gebruikt (25).
lichtbron voor fototoxiciteit. Lichtbron voor fototoxiciteit is uiterst belangrijk omdat de door de teststof geabsorbeerde golflengten (absorptiespectrum) en de dosis licht (haalbaar binnen een redelijke Blootstellingstijd) voldoende moeten zijn om fototoxiciteit te induceren (26). Zonnesimulatoren die natuurlijk zonlicht simuleren worden beschouwd als de ideale kunstlichtbron (Fig. 5).
de verdeling van het stralingsvermogen van de gefilterde zonnesimulator moet dicht bij die van het daglicht in de open lucht liggen. Zonnesimulatoren zijn uitgerust met xenonbogen of (gedoteerde) kwik-metaalhalidebogen. Zij moeten ook op passende wijze worden gefilterd om de zeer cytotoxische UVB-golflengten te verzwakken. Het onder deze filters opgenomen spectrum mag niet afwijken van gestandaardiseerd buiten daglicht (specificatie: FDA CFR Part 201.327, ISO 24444:2010(e), CIE-85-1989).
Niettemin kan een andere UvA-Lichtbron, zoals UvA-lamp, ook worden gebruikt met een geschikte UV-dosimeter om de intensiteit en Golflengte te controleren. De intensiteit van het licht (irradiantie) varieert afhankelijk van de bronnen en moet regelmatig worden gecontroleerd vóór elke fototoxiciteitstest met behulp van een geschikte breedband-UV-meter. De UV-meter moet vóór elke meting gekalibreerd zijn. De bestralingstijd is derhalve afhankelijk van de intensiteit van de lichtbron (bij een lichtbron van 1,7 mW/cm2 is bijvoorbeeld 50 minuten belichtingstijd nodig om 5 J/cm2 te bereiken). De bestralingstijd varieert ook afhankelijk van de testmethoden. Bij een dosis van 5 J/cm2 (gemeten in het UvA-bereik) werd vastgesteld dat deze niet-cytotoxisch was, maar voldoende krachtig om chemicaliën te prikkelen om fototoxische reacties op te wekken in een 3T3 Neutral red opnametest.
3T3 neutrale rode opnametest. 3T3 NRU-test is officieel goedgekeurd door de OESO en goedgekeurd als OESO TG432 in 13 April 2004 (3). Deze test evalueert de fotocytotoxiciteit door de relatieve vermindering van de levensvatbaarheid van de cellen na blootstelling aan het testartikel in aanwezigheid versus afwezigheid van UV/VIS-straling te bepalen. Er wordt besloten om een 3T3 NRU-fototoxiciteitstest uit te voeren voor de chemische stoffen die absorptiespectra vertonen in het UV/VIS-gebied wanneer ze opgelost zijn in een geschikt oplosmiddel (17). Er is gesuggereerd dat als de molaire extinctie/absorptiecoëfficiënt minder dan 10 liter x mol−1 x cm−1 is, de chemische stof waarschijnlijk niet fotoreactief is (bij UV-cuvet met een lichtweg van 1 cm moet de OD van 0,05 m oplossing minder dan 0,5 zijn om als niet-fotoreactief te worden beschouwd op basis van de vergelijking “absorbance = extinctiecoëfficiënt x weglengte x concentratie”) (26). 3T3 NRU-test vertoont een zeer gevoelige maar lage specifieke voorspellende capaciteit (een gevoeligheid van 93% en een specificiteit van 84%). 3T3 NRU-test heeft vele beperkingen. Het kan geen andere nadelige effecten dan fototoxiciteit(cytotoxiciteit)voorspellen die kunnen voortvloeien uit de gecombineerde werking van een chemische stof en licht, zoals fotogenotoxiciteit, fotoallergie(fotosensibilisatie) of fotocarcinogeniciteit. 3T3 NRU-test wordt alleen gebruikt voor de identificatie van gevaren, terwijl het nut ervan voor de beoordeling van de fototoxische potentie niet gerechtvaardigd is.In het bijzonder, ontbreekt dit analysesysteem metabolische activiteit die in de manifestatie van systemisch blootgestelde chemische producten kritiek is. Daarom worden in vivo dierstudies aanbevolen voor systemisch blootgestelde chemische stoffen die metabole activering vereisen, zoals monocrotaline, riddelliine en heliotrine (pyrrolizidine-alkaloïden) (28) (5,29).
fundamenteel testprincipe van 3T3 NRU is de vergelijking van de levensvatbaarheid van de cellen in aanwezigheid of afwezigheid van UV/Vis-straling, zoals bepaald met vitale kleurstof, neutraal rood, een zwakke kationische kleurstof die gemakkelijk celmembranen binnendringt en intracellulair accumuleert in lysosomen van levensvatbare cellen. De basiscellijn is Balb / C 3T3 cel, die muizenfibroblast is ontwikkeld uit muizenembryo ‘ s door G. T. Todaro in 1968. 3T3 aanduiding staat voor “3-day transfer, entmateriaal 3 × 105 cellen” in 20 cm2 schotel, en deze cel is relatief stabiel, gemakkelijk beschikbaar en gemakkelijk te hanteren (30). Huidfibroblast is één van doelcellen met fototoxiciteit die een solide motivering voor het gebruik van 3T3-cellen bieden.
om te bepalen of het testartikel al dan niet fototoxisch is in een 3T3 NRU-test, moet de concentratie-respons worden verkregen in aanwezigheid en in afwezigheid van bestraling. De foto-irritatiefactor (PIF) of het gemiddelde Foto-Effect (MPE) worden berekend (31). PIF is de verhouding van IC50 (concentratie die de levensvatbaarheid van de cellen met 50% vermindert) van niet-bestraald over bestraald zoals weergegeven in Fig. 7.
wanneer IC50 niet kan worden verkregen, wordt de maximaal toelaatbare fout berekend als volgt: vergelijking
PIF < 2 of een maximaal toelaatbare fout < 0,1 voorspelt: “geen fototoxiciteit”. Een PIF > 2 en < 5 of een maximaal toelaatbare fout > 0,1 en < 0,15 voorspelt: “waarschijnlijke fototoxiciteit” en PIF > 5 of een maximaal toelaatbare fout > 0,15 voorspelt: “fototoxiciteit” (Fig. 8).
erytrocyt hemolysetest. Celmembranen zijn kwetsbaar voor fotochemisch gegenereerde ROS en radicalen. UvA-geïnduceerde schade aan erytrocyten en resulterende hemolyse (fotohemolyse)wordt gekapitaliseerd om het fototoxische potentieel van testartikelen te beoordelen (32). Schapen rode bloedcellen (SRBC) worden geïncubeerd met chemicaliën en doorstraald met Uva bij 20 J/cm2. Na bestraling werden Srbc ’s in het donker geïncubeerd gedurende 2 uur bij kamertemperatuur en vervolgens nog eens 1 uur bij 37℃, waarna de hemolyse werd gemeten met Drabkin’ s reagens en de meting van de UV-absorptie bij 540 nm. De mate van fototoxiciteit werd beoordeeld aan de hand van de afgifte van hemoglobine uit SRBC, d.w.z. fotohemolytische activiteit volgens vergelijking (33).
-
ADE: optische dichtheid van blootgestelde geneesmiddeloplossing met erytrocyten
-
AD: optische dichtheid van blootgestelde geneesmiddeloplossing zonder erytrocyten
-
C: optische dichtheid van 100% hemolytische controleoplossing
Fototoxicantia zoals ciprofloxacine, norfloxacine of enoxacine verhogen de fotohemolytische activiteit significant tot meer dan 20% bij 100 µg/mL. De gevoeligheid, specificiteit en nauwkeurigheid van deze test waren respectievelijk 67%, 73% en 73% voor 24 chemische stoffen (8 Geurstoffen, 5 UV-absorbers, 4 geneesmiddelen, 4 antimicrobiële stoffen en 3 kleurstoffen) in vergelijking met de in vivo cavia test (34). De lage gevoeligheid kan problematisch zijn en zijn prestaties zijn veel inferieur aan die van 3T3 NRU-test, die het verminderde gebruik van deze test onlangs kan verklaren.
in vitro humaan 3D epidermis model. Om de beperkingen van in vitro cel-gebaseerde methoden te overwinnen, wordt het 3D gereconstrueerde epidermismodel onderzocht voor toepassing op fototoxiciteitstesten (35,36). In principe is het testprincipe vergelijkbaar met de 3T3 NRU-test, namelijk de beoordeling van het verschil in weefsellevensvatbaarheid tussen aan-en afwezigheid van UV/VIS-straling. Een vergelijkbaar voorspellingsmodel met PIF en MPE kan worden gebruikt (37). In het 3D-epidermismodel kunnen echter in water onoplosbare materialen worden getest en wordt een zekere mate van metabole capaciteit behouden in de primaire keratinocyten in de epidermale laag die kan worden toegepast op de toxicanten die metabole activering vereisen (38). Bovendien zijn metingen van cytokineproductie zoals IL-1β (interleukine-1β) (39), comet-bepaling (40) en histologisch onderzoek mogelijk die kunnen worden overwogen bij de verdere evaluatie van fotoallergeniciteit en fotocarcinogeniteit.
in vivo methoden waarbij cavia ‘ s, muizen of gepigmenteerde ratten worden gebruikt. Proefdieren zoals muizen en cavia ‘ s worden ingezet om het levensechte scenario van menselijke fototoxiciteit te simuleren. De dieren worden plaatselijk of systemisch aan chemische stoffen blootgesteld en bestraald met een passende dosis UVA (in het algemeen 10 J/cm2 voor de proef met cavia ‘ s, 20 J/cm2 voor de proef met muizen (41)). Score van erytheem en oedeem van 0 tot 4 wordt samengevat en maximale score gedurende 72 uur observatie wordt gemiddeld per dier om irritatie-index te genereren. De fototoxiciteitsindex wordt verkregen met de vergelijking “Irritation index of UVA-bestraald – Irritation index of non-bestraald site” (42). Fototoxiciteitsindex boven 0,6 geeft het potentieel van fototoxiciteit aan. Als alternatief kan de oordikte worden gemeten om oedeem in muistests te schatten. Deze in vivo tests weerspiegelen goed het pathofysiologische proces van fototoxiciteit bij de mens, maar offers van dieren, kosten en tijd die nodig zijn om de test uit te voeren levert veel problemen op, vooral in het tijdperk van een breed verspreid bewustzijn van dierenwelzijn en ethiek. Niet-dierlijke fototoxiciteitstesten winnen tegenwoordig aan populariteit om deze problemen op te lossen (43).
in chemico methods for phototoxicity evaluation. De cel-vrije test-buismethoden, namelijk in chemico zijn onderzocht om fototoxicity te beoordelen. Informatie over lichtabsorptie en fotostabiliteit van het testartikel is geanalyseerd om fototoxiciteit te voorspellen (44). Gebruikmakend van de generatie van reactieve zuurstofspecies tijdens fotoexcitatie en daaropvolgende fotoreactie, kan het fototoxische potentieel van een chemische stof worden geëvalueerd in chemico(12). Singlet zuurstof wordt gedetecteerd door p-nitrosodimethylaniline (RNO) bleken terwijl Nitro Blauw-Tetrazolium Test (NBT-formazan reactie) is toegepast om te bepalen peroxide generatie zoals hieronder afgebeeld (24),
-
Singlet zuurstof + imidazool
-
→ → geoxideerd imidazool
-
+ RNO
-
→ RNO bleken + producten
ROS generatie gehalte vertoonde de gevoeligheid en specificiteit van 90% en 76,9% voor cosmetica en 100% en 75% voor de niet-cosmetische chemie. De bundel het breken activiteit van DNA is een andere manier om UV veroorzaakte fototoxiciteit van verschillende soorten chemische producten, of drugs in chemico te evalueren door open of gesloten cirkeldna te kwantificeren. Deze analyse vereist ook geen levende cellen of weefsels, maar plasmide. Plasmide wordt opgelost in buffer en gemengd met testartikelen. Nadat het mengsel met UV is bestraald, worden de monsters aan elektroforese onderworpen. De hoeveelheid breukdna wordt geanalyseerd door fluorescente-gebaseerde technologie. UV-geïnduceerde fototoxische samenstelling resultaten opening DNA strengen en het is afhankelijk van geneesmiddelconcentratie en UV-bestralingsdosis (33). Deze tests vereisen geen levende cellen of weefsels die aan de veranderlijkheid van testresultaten kunnen toevoegen. Nochtans, hebben deze methodes beperkingen die gebrek aan metabolische activeringscapaciteit, inapplicability van in water onoplosbare materialen (oliën, vaste stoffen, gels, geformuleerde producten) omvatten, en onvermogen om photogenotoxicity, photoallergy(photosensibilization) of fotocarcinogenicity te voorspellen. Deze test is beperkt tot de identificatie van de gevaren, Niet voor een beoordeling van de fototoxische potentie.