PMC

metody badań fototoksyczności i alternatyw dla zwierząt

istotne jest zapewnienie bezpieczeństwa fototoksyczności chemikaliów, gdy istnieją szanse na narażenie ludzi, co można wyraźnie zilustrować w farmaceutykach (20) lub kosmetykach (21). W celu oceny potencjału fototoksyczności substancji chemicznej wprowadzono różne metody badań, od in silico(22), in chemico(23), in vitro do in vivo. W testach chemicznych, takich jak generacja ROS (24), opracowano i rutynowo stosowano test in vitro obejmujący test 3T3 NRU i model naskórka 3D oraz badania In vivo z udziałem świnki morskiej, myszy lub szczurów pigmentowanych (25).

Źródło Światła Do fototoksyczności. Źródło światła dla fototoksyczności jest niezwykle ważne, ponieważ długości fal pochłaniane przez badaną substancję chemiczną (widmo absorpcji) i dawka światła (osiągalna w rozsądnym czasie ekspozycji) powinny być wystarczające do wywołania fototoksyczności (26). Symulatory słoneczne symulujące naturalne światło słoneczne są uważane za idealne sztuczne źródło światła (rys. 5).

rozkład mocy napromieniowania filtrowanego symulatora słonecznego powinien być zbliżony do rozkładu światła dziennego Na Zewnątrz. Symulatory solarne wyposażone są w łuki ksenonowe lub (domieszkowane) łuki rtęciowo-metalohalogenkowe. Powinny być również odpowiednio filtrowane, aby złagodzić wysoce cytotoksyczne długości fal UVB. Widmo zarejestrowane poniżej tych filtrów nie powinno odbiegać od znormalizowanego światła dziennego Na Zewnątrz (Specyfikacja: FDA CFR część 201.327, ISO 24444: 2010 (E), CIE-85-1989).

niemniej jednak inne źródło światła UVA, takie jak lampa UVA, może być również używane z odpowiednim DOZYMETREM UV, aby sprawdzić intensywność i długość fali. Natężenie światła (natężenie promieniowania) różni się w zależności od źródła i powinno być regularnie sprawdzane przed każdym badaniem fototoksyczności za pomocą odpowiedniego szerokopasmowego miernika UV. Miernik UV musi być skalibrowany przed każdym pomiarem. W związku z tym czas napromieniowania zależy od natężenia Źródła światła (np. dla źródła światła o mocy 1,7 mW/cm2 konieczny jest czas ekspozycji 50 minut, aby osiągnąć 5 J/cm2). Czas napromieniowania różni się również w zależności od metod badawczych. Dawka 5 J / cm2 (mierzona w zakresie UVA) została określona jako niecytotoksyczna, ale wystarczająco silna, aby pobudzać chemikalia do wywoływania reakcji fototoksycznych w teście 3T3 neutral red absorption.

test wychwytu Czerwieni neutralnej 3T3. Test 3T3 NRU został oficjalnie zatwierdzony przez OECD i zatwierdzony jako OECD TG432 w dniu 13 kwietnia 2004 r. (3). W badaniu tym ocenia się fotocytotoksyczność, określając względne zmniejszenie żywotności komórek po ekspozycji na badany artykuł w obecności lub braku napromieniowania UV/VIS. Decyzja o przeprowadzeniu badania fototoksyczności 3T3 NRU jest podejmowana dla substancji chemicznych wykazujących widma absorpcji w obszarze UV / VIS po rozpuszczeniu w odpowiednim rozpuszczalniku (17). Sugeruje się, że jeśli molowy współczynnik ekstynkcji/absorpcji jest mniejszy niż 10 litrów x mol−1 x cm−1, jest mało prawdopodobne, aby substancja chemiczna była fotoreaktywna (np. w kuwecie UV o ścieżce światła o długości 1 cm, OD roztworu o długości 0,05 M jest mniejsza niż 0,5, aby można ją było uznać za nie fotoreaktywną na podstawie równania „absorbancja = współczynnik ekstynkcji x Długość ścieżki x stężenie”) (26). Test 3T3 NRU wykazuje bardzo czułą, ale niską specyficzną zdolność predykcyjną (czułość 93% i specyficzność 84%). Test 3T3 NRU ma wiele ograniczeń. Nie jest w stanie przewidzieć niekorzystnych skutków innych niż fototoksyczność(cyto), które mogą wynikać z połączonego działania substancji chemicznej i światła, takich jak fotogenotoksyczność, fotoalergia(fotouczulanie) lub fotokarcynogenność. Test 3T3 NRU jest stosowany wyłącznie do identyfikacji zagrożeń, podczas gdy jego przydatność do oceny działania fototoksycznego nie jest uzasadniona.W szczególności w tym systemie testowym brakuje aktywności metabolicznej, która ma kluczowe znaczenie dla manifestacji systemowo narażonych substancji chemicznych. W związku z tym, w przypadku substancji chemicznych narażonych na działanie układu, które wymagają aktywacji metabolicznej, takich jak monokrotalina, riddelliina i heliotryna (alkaloidy pirolizydynowe) (28), zaleca się badania in vivo na zwierzętach (5,29).

podstawową zasadą testu 3T3 NRU jest porównanie żywotności komórek w obecności lub braku napromieniowania UV/Vis, jak określono za pomocą barwnika witalnego, Czerwieni neutralnej, który jest słabym kationowym barwnikiem, który łatwo przenika przez błony komórkowe i gromadzi się wewnątrzkomórkowo w lizosomach żywotnych komórek. Podstawową linią komórkową jest komórka Balb/c 3T3, czyli mysi fibroblast opracowany z zarodków myszy przez G. T. Todaro w 1968 roku. Oznaczenie 3T3 oznacza „3-dniowy transfer, inokulum 3 × 105 komórek” w naczyniu o powierzchni 20 cm2, a komórka ta jest stosunkowo stabilna, łatwo dostępna i łatwa w obsłudze (30). Fibroblast skórny jest jedną z komórek docelowych fototoksyczności, dostarczającą solidnych podstaw do wykorzystania komórek 3T3.

aby zdecydować, czy badany artykuł jest fototoksyczny, czy nie w teście 3T3 NRU, należy uzyskać odpowiedź stężenie-w obecności i przy braku napromieniowania. Należy obliczyć współczynnik podrażnienia (PIF) lub średni efekt fotograficzny (MPE) (31). PIF jest stosunkiem IC50 (stężenie, które zmniejsza żywotność komórek o 50%) nie napromieniowanego nad napromieniowanym, jak pokazano na Fig. 7.

Prediction model of Photocytotoxicity by PIF (Photo-irritation factor).

gdy nie można uzyskać IC50, MPE oblicza się w następujący sposób

PIF < 2 lub MPE < 0.1 PIF > 2 i < 5 lub MPE > 0, 1 i < 0, 15 przewiduje: „prawdopodobną fototoksyczność” i PIF > 5 lub MPE > 0, 15 przewiduje: „fototoksyczność” (ryc. 8).

obliczanie efektu fotograficznego: efekt fotograficzny (PEC) w dowolnym stężeniu C definiuje się jako iloczyn efektu reakcji (REC) i efektu dawki (DEC), tj. PEC = REC × DEC. Definicja jest zilustrowana jako przyjęta od (31). Obliczanie efektu fotograficznego przy stężeniu 0,4 zgodnie z równaniami podanymi w tekście daje: efekt reakcji RE0.4 = (66% − 11%)/100% = 0.55, dose effect DE0.4 = (0.4/0.16 − 1)/(0.4/0.16 + 1) = 0.43, a efekt fotograficzny PE0.4 = 0,24. Średni efekt fotograficzny uzyskuje się przez uśrednianie wartości efektu fotograficznego w różnych stężeniach (31).

Test hemolizy erytrocytów. Błony komórkowe są wrażliwe na fotochemicznie generowane ROS i rodniki. Uszkodzenia erytrocytów i hemolizy wywołane przez UVA (fotohemoliza)są kapitalizowane w celu oceny potencjału fototoksycznego artykułów testowych (32). Owce czerwone krwinki (SRBC) inkubuje się z chemikaliami i napromieniowuje UVA przy 20 J/cm2. Po napromieniowaniu SRBCs inkubowano w ciemności przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, a następnie przez kolejne 1 godzinę w temperaturze 37℃, po czym mierzono hemolizę za pomocą odczynnika Drabkina i pomiar absorbancji UV przy 540 nm. Stopień fototoksyczności oceniano na podstawie uwalniania hemoglobiny z SRBC, tj. aktywności fotohemolitycznej zgodnie z równaniem (33).

• ADE: gęstość optyczna roztworu leku z erytrocytami

• AD: gęstość optyczna roztworu leku bez erytrocytów

• C: gęstość optyczna 100% roztworu kontrolnego hemolitycznego

substancje fototoksyczne, takie jak cyprofloksacyna, norfloksacyna lub enoksacyna, znacznie zwiększają aktywność fotohemolityczną powyżej 20% przy stężeniu 100 µg/mL. Czułość, swoistość i dokładność tego testu wynosiły odpowiednio 67%, 73% i 73% dla 24 substancji chemicznych (8 substancji zapachowych, 5 absorberów UV, 4 leków, 4 środków przeciwdrobnoustrojowych i 3 barwników) w porównaniu z testem na świnkach morskich in vivo (34). Niska czułość może być problematyczna, a jej wydajność jest znacznie niższa niż w przypadku testu 3T3 NRU, co może wyjaśniać zmniejszone wykorzystanie tego testu w ostatnim czasie.

in vitro model ludzkiego naskórka 3D. Aby przezwyciężyć ograniczenia metod opartych na komórkach in vitro, analizuje się zrekonstruowany model 3D naskórka do zastosowania w badaniach fototoksyczności (35,36). Zasadniczo zasada badania jest podobna do testu 3T3 NRU, a mianowicie ocena różnicy żywotności tkanek między obecnością i brakiem promieniowania UV/VIS. Można wykorzystać podobny model przewidywania wykorzystujący PIF i MPE (37). W modelu 3D naskórka można jednak badać materiały nierozpuszczalne w wodzie i zachować pewien stopień zdolności metabolicznej w pierwotnych keratynocytach w warstwie naskórka, które można zastosować do substancji toksycznych wymagających aktywacji metabolicznej (38). Ponadto możliwe są pomiary produkcji cytokin, takie jak IL-1β (interleukina-1β) (39), test komety (40) i badanie histologiczne, które można uwzględnić w dalszej ocenie fotoalergiczności i fotokarcynogenności.

metody In vivo wykorzystujące świnkę morską, myszy lub pigmentowane szczury. Zwierzęta laboratoryjne, takie jak myszy i świnki morskie, są wykorzystywane do symulacji rzeczywistego scenariusza fototoksyczności u ludzi. Zwierzęta są poddawane działaniu substancji chemicznych miejscowo lub systemowo i napromieniowywane odpowiednią dawką UVA (zazwyczaj 10 J/cm2 w przypadku badania na świnkach morskich, 20 J/cm2 w przypadku badania na myszach (41)). Punktacja rumienia i obrzęku od 0 do 4 jest sumowana, a maksymalna ocena podczas 72 godzin obserwacji jest uśredniana na zwierzę, aby wygenerować wskaźnik podrażnienia. Wskaźnik fototoksyczności otrzymuje się za pomocą równania „wskaźnik podrażnienia miejsca napromieniowanego UVA-wskaźnik podrażnienia miejsca nienapromieniowanego” (42). Wskaźnik fototoksyczności powyżej 0,6 wskazuje na możliwość fototoksyczności. Alternatywnie, grubość ucha może być mierzona w celu oszacowania obrzęku w testach na myszach. Te testy in vivo dobrze odzwierciedlają patofizjologiczny proces fototoksyczności u ludzi, ale ofiary ze zwierząt, wydatki i czas potrzebny do przeprowadzenia testu stwarzają wiele problemów, zwłaszcza w dobie szeroko rozpowszechnionej świadomości dobrostanu zwierząt i etyki. Badania fototoksyczności oparte na zwierzętach zyskują obecnie na popularności, aby przezwyciężyć te problemy (43).

In chemico methods for phototoxicity evaluation. W celu oceny fototoksyczności zbadano metody bezkomórkowe, mianowicie w chemii. Informacje na temat absorbancji światła i fotostabilności artykułu testowego zostały przeanalizowane w celu przewidywania fototoksyczności (44). Wykorzystując wytwarzanie reaktywnych form tlenu podczas fotoeksykacji, a następnie fotoreakcji, potencjał fototoksyczny substancji chemicznej można ocenić w chemico(12). Tlen singletowy jest wykrywany przez wybielanie P-nitrozodimetyloaniliny (RNO), podczas gdy test Nitro Blue-Tetrazolium (reakcja NBT-formazan) jest stosowany do oznaczania wytwarzania nadtlenku, jak przedstawiono poniżej (24),

• tlen singletowy + imidazol

• → → utleniony imidazol

• + RNO

• → RNO wybielanie + produkty

test generacji ROS wykazał czułość i swoistość 90% i 76,9% dla kosmetyków oraz 100% i 75% dla chemikaliów nie kosmetycznych. DNA strand breaking activity is another way to evaluate UV induced phototoxicity of different kinds of chemical, or drugs in chemico through quantifying open or closed circular DNA. Test ten nie wymaga również żywych komórek lub tkanek, ale plazmidu. Plazmid rozpuszcza się w buforze i miesza z artykułami badawczymi. Po napromieniowaniu mieszaniny promieniowaniem UV próbki poddaje się elektroforezie. Ilość pęknięcia DNA jest analizowana za pomocą technologii fluorescencyjnej. Związek fototoksyczny wywołany promieniowaniem UV powoduje otwarcie nici DNA i jest zależny od stężenia leku i dawki promieniowania UV (33). Badania te nie wymagają żywych komórek lub tkanek, które mogą zwiększyć zmienność wyników badań. Jednak metody te mają ograniczenia, które obejmują brak zdolności aktywacji metabolicznej, niemożność zastosowania materiałów nierozpuszczalnych w wodzie (oleje, ciała stałe, żele, produkty gotowe) i niezdolność do przewidywania fotogenotoksyczności, fotoalergii(fotouczulenia) lub fotokarcynogenności. Badanie to ogranicza się do identyfikacji zagrożenia, a nie do oceny działania fototoksycznego.