METODI DI PROVA PER LA FOTOTOSSICITÀ E le ALTERNATIVE PER GLI ANIMALI
È essenziale garantire la fotosicurezza delle sostanze chimiche quando vi sono possibilità di esposizione umana, come chiaramente esemplificato dai prodotti farmaceutici (20) o dai cosmetici (21). Per valutare il potenziale di fototossicità di una sostanza chimica, sono stati introdotti vari metodi di prova che vanno da in silico(22), in chimico(23), in vitro a in vivo. In saggi chimici come la generazione di ROS (24), sono stati sviluppati e utilizzati abitualmente test in vitro che includono il test 3T3 NRU e il modello 3D dell’epidermide e studi in vivo che impiegano cavia, topo o ratti pigmentati (25).
Sorgente luminosa per fototossicità. La sorgente luminosa per la fototossicità è estremamente importante poiché le lunghezze d’onda assorbite dalla sostanza in esame (spettro di assorbimento) e la dose di luce (ottenibile in un tempo di esposizione ragionevole) dovrebbero essere sufficienti per indurre fototossicità (26). I simulatori solari che simulano la luce solare naturale sono considerati la fonte di luce artificiale ideale (Fig. 5).
La distribuzione dell’energia di irradiazione del simulatore solare filtrato dovrebbe essere vicina a quella della luce diurna esterna. I simulatori solari sono dotati di archi allo xeno o archi alogenuri metallici al mercurio (drogati). Dovrebbero anche essere opportunamente filtrati per attenuare le lunghezze d’onda UVB altamente citotossiche. Lo spettro registrato al di sotto di questi filtri non deve discostarsi dalla luce diurna esterna standardizzata (Specifica: FDA CFR Part 201.327, ISO 24444:2010(e), CIE-85-1989).
Tuttavia, altre sorgenti luminose UVA come la lampada UVA possono essere utilizzate anche con un dosimetro UV adeguato per controllare l’intensità e la lunghezza d’onda. L’intensità della luce (irradianza) varia a seconda delle fonti e deve essere controllata regolarmente prima di ogni test di fototossicità utilizzando un UV-meter a banda larga adatto. L’UV-meter deve essere stato calibrato prima di ogni misurazione. Di conseguenza, il tempo di irradiazione dipende dall’intensità della sorgente luminosa (ad esempio, per una sorgente luminosa di 1,7 mW/cm2, sono necessari 50 minuti di esposizione per ottenere 5 J/cm2). Anche il tempo di irradiazione varia a seconda dei metodi di prova. Una dose di 5 J / cm2 (misurata nell’intervallo UVA) è stata determinata non citotossica ma sufficientemente potente da eccitare le sostanze chimiche per provocare reazioni fototossiche nel saggio di assorbimento rosso neutro 3T3.
3T3 Saggio di assorbimento rosso neutro. Il test 3T3 NRU è stato ufficialmente approvato dall’OCSE e approvato come OCSE TG432 in 13th April 2004 (3). Questo test valuta la fotocitotossicità determinando la riduzione relativa della vitalità cellulare dopo l’esposizione all’articolo di prova in presenza o assenza di irradiazione UV/VIS. Si sta prendendo la decisione di effettuare il test di fototossicità 3T3 NRU per le sostanze chimiche che mostrano spettri di assorbimento nella regione UV/VIS quando disciolte in solvente appropriato (17). È stato suggerito che, se l’estinzione molare/coefficiente di assorbimento è inferiore a 10 litri x mol−1 x cm−1 la chimica è improbabile che sia fotoreattivo (ad esempio, In cuvette UV con 1 cm lungo percorso di luce, diametro esterno (OD) 0,05 M soluzione deve essere inferiore a 0,5 a essere considerata come non fotoreattivo basato sull’equazione “assorbanza = coefficiente di estinzione x la lunghezza del percorso x concentrazione”) (26). Il test 3T3 NRU presenta una capacità predittiva specifica altamente sensibile ma bassa (una sensibilità del 93% e una specificità dell ‘ 84%). Il test 3T3 NRU ha molte limitazioni. Non è in grado di prevedere effetti avversi diversi dalla foto(citotossicità)che possono derivare dall’azione combinata di una sostanza chimica e della luce come la fotogenotossicità, la fotoallergia(fotosensibilizzazione) o la fotocarcinogenicità. Il test 3T3 NRU viene impiegato solo per l’identificazione del pericolo mentre la sua utilità per la valutazione della potenza fototossica non è giustificata.In particolare, questo sistema di analisi manca di attività metabolica che è fondamentale nella manifestazione di sostanze chimiche esposte sistemicamente. Pertanto, per i prodotti chimici sistemicamente esposti che richiedono l’attivazione metabolica come la monocrotalina, la riddelliina e l’eliotrina (alcaloidi pirrolizidinici) (28), si raccomandano studi su animali in vivo (5,29).
Principio fondamentale del test di 3T3 NRU è il confronto della vitalità cellulare in presenza o assenza di irradiazione UV/Vis come determinato con colorante vitale, rosso neutro, che è un colorante cationico debole che penetra facilmente nelle membrane cellulari e si accumula intracellulare nei lisosomi delle cellule vitali. La cellula-linea di base è cellula di Balb/c 3T3, che è fibroblasto del topo sviluppato dagli embrioni del topo da GT Todaro nel 1968. La designazione 3T3 sta per “trasferimento di 3 giorni, inoculo 3 × 105 celle” in un piatto da 20 cm2, e questa cella è relativamente stabile, facilmente disponibile e facile da maneggiare (30). Il fibroblasto dermico è una delle cellule bersaglio di fototossicità che fornisce una solida motivazione per l’impiego di cellule 3T3.
Per decidere se l’articolo di prova è fototossico o meno nel saggio 3T3 NRU, la concentrazione-risposta deve essere ottenuta in presenza e in assenza di irradiazione. Si calcola il fattore di fotoirritazione (PIF) o il fotoeffetto medio (MPE) (31). PIF è il rapporto di IC50 (concentrazione che diminuisce la vitalità cellulare del 50%) di non irradiato su irradiato come mostrato in Fig. 7.
Quando IC50 non può essere ottenuto, MPE viene calcolato come seguente equazione
PIF < 2 o un MPE < 0.1 predice: “nessuna fototossicità”. Un PIF > 2 e < 5 o un MPE > 0.1 e < 0.15 predice: “fototossicità probabile” e PIF > 5 o un MPE > 0.15 predice: “fototossicità” (Fig. 8).
Test di emolisi degli eritrociti. Le membrane cellulari sono vulnerabili a ROS e radicali generati fotochimicamente. I danni indotti dai raggi UVA degli eritrociti e l’emolisi risultante (fotoemolisi)sono capitalizzati per valutare il potenziale fototossico degli articoli di prova (32). I globuli rossi ovini (SRBC) vengono incubati con sostanze chimiche e irradiati con UVA a 20 J/cm2. Dopo l’irradiazione, gli SRBC sono stati incubati al buio per 2 ore a temperatura ambiente e poi per un ulteriore 1 ora a 37℃, dopo di che l’emolisi è stata misurata con il reagente di Drabkin e la misurazione dell’assorbanza UV a 540 nm. L’entità della fototossicità è stata valutata mediante il rilascio di emoglobina da SRBC, cioè attività fotoemolitica come segue equazione (33).
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ADE: densità ottica della soluzione farmacologica esposta con eritrociti
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AD: densità ottica della soluzione farmacologica esposta senza eritrociti
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C: densità ottica della soluzione emolitica di controllo di 100%
I fototossici come ciprofloxacina, norfloxacina o enoxacina aumentano significativamente l’attività fotoemolitica oltre il 20% a 100 µg/mL. La sensibilità, la specificità e l’accuratezza di questo test sono state rispettivamente del 67%, 73% e 73% per 24 sostanze chimiche (8 fragranze, 5 assorbitori UV, 4 farmaci, 4 antimicrobici e 3 coloranti) rispetto al test in vivo su cavia (34). La bassa sensibilità può essere problematica e le sue prestazioni sono molto inferiori a quelle del test 3T3 NRU, il che potrebbe spiegare il ridotto uso di questo test di recente.
Modello umano in vitro dell’epidermide 3D. Per superare i limiti dei metodi basati su cellule in vitro, si sta studiando un modello di epidermide ricostruito in 3D per l’applicazione ai test di fototossicità (35,36). Fondamentalmente il principio del test è simile al test 3T3 NRU, vale a dire la valutazione della differenza di vitalità tissutale tra la presenza e l’assenza di irradiazione UV/VIS. Può essere utilizzato un modello di previsione simile che impiega PIF e MPE (37). Nel modello dell’epidermide 3D, tuttavia, i materiali insolubili in acqua possono essere testati e una certa misura della capacità metabolica è preservata nei cheratinociti primari nello strato epidermico che può essere applicato alle sostanze tossiche che richiedono l’attivazione metabolica (38). Inoltre, è possibile misurare la produzione di citochine come IL-1β (Interleuchina-1β) (39), il saggio della cometa (40) e l’esame istologico che possono essere considerati nell’ulteriore valutazione della fotoallergenicità e della fotocarcinogenecità.
Metodi in vivo che impiegano cavia, topo o ratti pigmentati. Animali da laboratorio come topi e porcellini d’india vengono impiegati per simulare scenari reali di fototossicità umana. Gli animali sono esposti a sostanze chimiche per via topica o sistemica e irradiati con un’adeguata dose di UVA (generalmente 10 J / cm2 per il test su cavia, 20 J/cm2 per il test su topo (41)). Il punteggio di eritema ed edema da 0 a 4 viene riassunto e il punteggio massimo durante 72 ore di osservazione viene calcolato in media per animale per generare indice di irritazione. L’indice di fototossicità è ottenuto mediante l’equazione “Indice di irritazione del sito irradiato dai raggi UVA – Indice di irritazione del sito non irradiato” (42). L’indice di fototossicità superiore a 0,6 indica il potenziale di fototossicità. In alternativa, lo spessore dell’orecchio può essere misurato per stimare l’edema nei test del topo. Questi test in vivo riflettono bene il processo fisiopatologico della fototossicità nell’uomo, ma i sacrifici degli animali, le spese e il tempo necessario per condurre il test pongono molti problemi soprattutto nell’era della consapevolezza diffusa del benessere e dell’etica degli animali. I test di fototossicità non basati su animali stanno guadagnando popolarità in questi giorni per superare questi problemi (43).
In metodi chimici per la valutazione della fototossicità. Per valutare la fototossicità sono stati studiati metodi in provetta senza cellule, in particolare in chimica. Sono state analizzate informazioni sull’assorbanza della luce e sulla fotostabilità dell’articolo di prova per prevedere la fototossicità (44). Impiegando la generazione di specie reattive dell’ossigeno durante la fotoeccitazione e la successiva fotoreazione, il potenziale fototossico di una sostanza chimica può essere valutato in chimico(12). Ossigeno singoletto è rilevato da p-nitrosodimethylaniline (RNO) sbiancamento mentre Nitro Blu-Tetrazolium Test (NBT-formazan reazione) è impiegato per determinare il perossido di generazione, come illustrato di seguito (24),
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ossigeno Singoletto + imidazolo
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→ → ossidato imidazolo
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+ RNO
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→ RNO sbiancamento + prodotti
la generazione di ROS dosaggio esposto la sensibilità e la specificità del 90% e il 76,9% per i cosmetici e il 100% e il 75% per i non-cosmetici, prodotti chimici. L’attività di rottura del filamento di DNA è un altro modo per valutare la fototossicità indotta dai raggi UV di diversi tipi di sostanze chimiche o farmaci in chimica attraverso la quantificazione del DNA circolare aperto o chiuso. Anche questo test non richiede cellule o tessuti vivi, ma plasmidi. Il plasmide viene disciolto in tampone e miscelato con articoli di prova. Dopo che la miscela è stata irradiata con UV, i campioni vengono sottoposti ad elettroforesi. La quantità di DNA di rottura è analizzata dalla tecnologia a base fluorescente. Il composto fototossico indotto dai raggi UV determina l’apertura di filamenti di DNA e dipende dalla concentrazione del farmaco e dalla dose di irradiazione UV (33). Questi test non richiedono cellule o tessuti vivi che possono aumentare la variabilità dei risultati dei test. Tuttavia, questi metodi hanno limitazioni che includono la mancanza di capacità di attivazione metabolica, l’inapplicabilità di materiali insolubili in acqua (oli, solidi, gel, prodotti formulati) e l’incapacità di prevedere fotogenotossicità, fotoallergia(fotosensibilizzazione) o fotocarcinogenicità. Questo test è limitato all’identificazione del pericolo, non per una valutazione della potenza fototossica.