MÉTODOS de ENSAIO PARA PHOTOTOXICITY E ANIMAIS ALTERNATIVAS
é essencial para garantir a photosafety de produtos químicos quando há chances de exposição humana, como pode ser claramente exemplificado por produtos farmacêuticos (20) ou cosméticos (21). Para avaliar o potencial de fototoxicidade de um produto químico, foram introduzidos vários métodos de ensaio que vão desde o ensaio in silico(22), no ensaio in vitro(23) até ao ensaio in vivo. Em ensaios químicos como a geração ROS (24), foram desenvolvidos e utilizados rotineiramente ensaios in vitro que incluem o ensaio NRU 3T3 e o modelo de epiderme 3D, e estudos in vivo que empregam cobaias, ratinhos ou ratos pigmentados (25).Fonte de luz para a fototoxicidade . A fonte luminosa de fototoxicidade é extremamente importante, uma vez que os comprimentos de onda absorvidos pelo produto químico em estudo (espectro de absorção) e a dose de luz (possível num período de exposição razoável) devem ser suficientes para induzir fototoxicidade (26). Simuladores solares que simulam a luz solar natural são considerados a fonte de luz artificial ideal (Fig. 5).
a distribuição da energia de irradiação do simulador solar filtrado deve ser próxima da da luz do dia exterior. Os simuladores solares estão equipados com arcos de xénon ou arcos de halogeneto mercúrio-metal (dopados). Devem também ser adequadamente filtrados para atenuar os comprimentos de onda UVB altamente citotóxicos. O espectro registado a seguir a estes filtros não deve desviar-se da luz do dia normalizada ao ar livre (Especificação: FDA CFR, Parte 201.327, ISO 24444:2010(e), CIE-85-1989).
no entanto, outra fonte de luz UVA como lâmpada UVA também pode ser usado com um dosímetro UV adequado para verificar a intensidade e comprimento de onda. A intensidade da luz (irradiância) varia em função das fontes e deve ser verificada regularmente antes de cada ensaio de fototoxicidade, utilizando um medidor de UV de banda larga adequado. O medidor de UV deve ter sido calibrado antes de cada medição. Assim, o tempo de irradiação depende da intensidade da fonte luminosa (por exemplo, para uma fonte luminosa de 1,7 mW/cm2, é necessário um tempo de exposição de 50 minutos para atingir 5 J/cm2). O tempo de irradiação também varia em função dos métodos de ensaio. Uma dose de 5 J/cm2 (medida no intervalo UVA) foi determinada como não citotóxica, mas suficientemente potente para excitar produtos químicos de modo a provocar reacções fototóxicas no ensaio de absorção de vermelho neutro 3T3.
3T3 ensaio de absorção de vermelho neutro. O ensaio NRU 3T3 foi oficialmente aprovado pela OCDE e aprovado como OECD TG432 em 13 de abril de 2004 (3). Este ensaio avalia a fotocitotoxicidade, determinando a redução relativa da viabilidade celular após a exposição ao artigo em estudo, na presença e na ausência de irradiação UV/VIS. É tomada a decisão de realizar um ensaio de fototoxicidade NRU 3T3 para os produtos químicos que apresentem espectros de absorção na região UV/VIS quando dissolvidos em solvente adequado (17). Tem sido sugerido que se molar de extinção/coeficiente de absorção é menor do que 10 litros x mol−1 x cm−1 a química é improvável de ser photoreactive (por exemplo, No UV tina com 1 cm de comprimento do caminho de luz, OD de 0,05 M a solução deve ser inferior a 0,5 a ser considerados como não-photoreactive com base na equação “absorvância = coeficiente de extinção x de comprimento de caminho de x a concentração”) (26). O teste NRU 3T3 apresenta uma capacidade preditiva altamente sensível mas baixa (uma sensibilidade de 93% e uma especificidade de 84%). O ensaio NRU 3T3 tem muitas limitações. Não pode prever outros efeitos adversos para além da toxicidade por fotografia(cito)que possam surgir da acção combinada de um produto químico e de uma luz como a fotogenotoxicidade, a fotoalergia(fotossensibilização) ou a fotocarcinogenicidade. 3T3 o ensaio NRU só está a ser utilizado para a identificação de perigos, enquanto a sua utilidade para a avaliação da potência fototóxica não se justifica.Em particular, este sistema de doseamento carece de actividade metabólica que é crítica na manifestação de produtos químicos sistemicamente expostos. Assim, para produtos químicos sistemicamente expostos que requerem activação metabólica como a monocrotalina, a riddellina e a heliotrina (alcalóides da pirrolizidina) (28), recomenda-se a realização de estudos in vivo em animais (5,29).
teste Fundamental princípio da 3T3 NRU é a comparação da viabilidade celular na presença ou ausência de UV/Vis de irradiação, conforme determinado com corante vital, vermelho neutro, que é um fraco corante catiônico que penetra facilmente as membranas celulares e a acumulação de intracellularly em lisossomos de células viáveis. A linha base de células é a célula Balb/c 3T3, que é o fibroblasto de ratinho desenvolvido a partir de embriões de ratinho por G. T. Todaro em 1968. 3T3 designação significa “transferência de 3 dias, inóculo 3 × 105 células” em pratos de 20 cm2, e esta célula é relativamente estável, prontamente disponível e fácil de manusear (30). O fibroblasto dérmico é uma das células-alvo da fototoxicidade, fornecendo uma fundamentação sólida para o emprego de 3T3 células.
para decidir se o artigo de ensaio é fototóxico ou não no ensaio 3T3 NRU, a resposta à concentração deve ser obtida na presença e na ausência de irradiação. Calcula-se o factor de Fotoirritação (PIF) ou o efeito fotográfico Médio (MPE) (31). PIF é a proporção de CI50 (concentração que diminui a viabilidade celular em 50%) de não irradiados sobre irradiação, como indicado no Fig. 7.
quando a IC50 não pode ser obtida, o MPE é calculado como segue a equação
PIF < 2 ou um MPE < 0.1 prevê: “sem fototoxicidade”. Um PIF > 2 e < 5 ou um MPE > 0.1 e < 0.15 prevê: “provável fototoxicidade” e PIF > 5 ou um MPE > 0.15 prevê: “fototoxicidade” (Fig. 8).
teste de hemólise eritrocitária. As membranas celulares são vulneráveis a MDE e radicais gerados fotocemicamente. Os danos causados pelos eritrocitos induzidos pelo UVA e a hemólise resultante (fotohemólise)são capitalizados para avaliar o potencial fototóxico dos artigos de ensaio (32). Os glóbulos vermelhos dos ovinos (SRBC) são incubados com produtos químicos e irradiados com UVA a 20 J/cm2. Após irradiação, os SRBCs foram incubados no escuro durante 2 horas à temperatura ambiente e depois durante mais 1 horas a 37℃, após o que a hemólise foi medida com o reagente de Drabkin e com a medição da absorvância UV A 540 nm. A extensão da fototoxicidade foi avaliada pela libertação de hemoglobina a partir de SRBC, ou seja, actividades fotoemolíticas de acordo com a equação (33).
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ADE: densidade óptica da solução exposta ao fármaco com eritrócitos
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AD: densidade óptica do exposto interações solução sem eritrócitos
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C: densidade óptica de 100% hemolítica solução de controle de
Phototoxicants como ciprofloxacina, norfloxacina ou enoxacina aumentar significativamente photohemolytic atividade além de 20% a 100 µg/mL. A sensibilidade, especificidade e precisão deste teste foram de 67%, 73% e 73%, respectivamente, para 24 produtos químicos (8 fragrâncias, 5 absorventes UV, 4 fármacos, 4 antimicrobianos e 3 corantes), em comparação com o teste in vivo da cobaia (34). A baixa sensibilidade pode ser problemática e o seu desempenho é muito inferior ao do ensaio NRU 3T3, o que pode explicar a diminuição da utilização deste ensaio recentemente.
in vitro modelo de epiderme humana 3D. Para superar as limitações dos métodos baseados em células in vitro, o modelo de epiderme reconstruída 3D está sendo investigado para a aplicação a testes de fototoxicidade (35,36). Basicamente, o princípio do ensaio é semelhante ao ensaio NRU 3T3, nomeadamente a avaliação da diferença de viabilidade dos tecidos entre a presença e a ausência de irradiação UV/VIS. Pode ser utilizado um modelo de previsão semelhante que emprega PIF e MPE (37). No modelo de epiderme 3D, no entanto, materiais insolúveis em água podem ser testados e uma certa extensão da capacidade metabólica é preservada nos queratinócitos primários na camada epidérmica que podem ser aplicados aos tóxicos que requerem ativação metabólica (38). Além disso, é possível medir a produção de citoquinas como a IL-1β (interleucina-1β) (39), o ensaio comet (40) e o exame histológico que podem ser considerados na avaliação adicional da fotoalergenicidade e da fotocarcinogeneidade.Métodos In vivo que empregam cobaias, ratinhos ou ratos pigmentados. Animais de laboratório, como ratos e cobaias, estão a ser empregados para simular um cenário de fototoxicidade humana na vida real. Os animais são expostos a produtos químicos por via tópica ou sistémica e irradiados com uma dose adequada de UVA (geralmente 10 J/cm2 para o ensaio em cobaias, 20 J/cm2 para o ensaio em ratos (41)). Soma-se a pontuação do eritema e do edema de 0 a 4 e calcula-se a pontuação máxima durante 72 horas de observação por animal para gerar Índice de irritação. O índice de fototoxicidade é obtido pela equação “Índice de irritação do Índice de irritação UVA-irradiado do local não irradiado” (42). O índice de fototoxicidade acima de 0, 6 indica o potencial de fototoxicidade. Em alternativa, a espessura da orelha pode ser medida para estimar o edema nos ensaios com ratos. Estes testes in vivo refletem bem o processo fisiopatológico de fototoxicidade em seres humanos, mas sacrifícios de animais, despesas e tempo necessários para realizar o teste coloca muitos problemas, especialmente na era da ampla conscientização sobre o bem-estar e a ética dos animais. Os testes de fototoxicidade não baseados em animais estão ganhando popularidade nos dias de hoje para superar esses problemas (43).
in chemico methods for phototoxicity evaluation. Foram explorados métodos de ensaio sem células, nomeadamente em química, para avaliar a fototoxicidade. Foram analisadas informações sobre a absorvância luminosa e a fotostabilidade do artigo de ensaio, a fim de prever a fototoxicidade (44). Utilizando a geração de espécies reactivas de oxigénio durante a fotoexcitação e subsequente fotoreação, o potencial fototóxico de uma substância química pode ser avaliado em chemico(12). O oxigênio singleto é detectado pelo p-nitrosodimethylaniline (RNO) branqueamento enquanto Nitro Azul-Tetrazolium Teste (NBT-formazan reação) é utilizado para determinar o peróxido de geração, como mostrado abaixo (24),
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o oxigênio Singleto + imidazol
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→ → oxidado imidazol
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+ RNO
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→ RNO clareamento + produtos
ROS de geração de ensaio apresentou sensibilidade e especificidade de 90% e de 76,9% para produtos cosméticos e de 100% e 75% para não-cosméticos produtos químicos. A atividade de quebra da cadeia de DNA é outra forma de avaliar a fototoxicidade induzida pelos UV de diferentes tipos de produtos químicos, ou drogas na quimico através da quantificação de DNA circular aberto ou fechado. Este ensaio também não requer células ou tecidos vivos, mas sim plasmídeos. O plasmídeo é dissolvido em tampão e misturado com artigos de ensaio. Após irradiação da mistura com UV, as amostras são submetidas a electroforese. A quantidade de ADN de ruptura é analisada por tecnologia fluorescente. O composto fototóxico induzido pela UV resulta na abertura de cadeias de ADN e depende da concentração do fármaco e da dose de irradiação UV (33). Estes testes não requerem células vivas ou tecidos que possam aumentar a variabilidade dos resultados dos testes. No entanto, estes métodos têm limitações que incluem a falta de capacidade de ativação metabólica, inaplicabilidade de materiais insolúveis em água (óleos, sólidos, géis, produtos formulados), e incapacidade de prever fotogenotoxicidade, fotoalergia(fotossensibilização) ou fotocarcinogenicidade. Este ensaio limita-se à identificação dos perigos e não à avaliação da potência fototóxica.