PMC

testmetoder för fototoxicitet och DJURALTERNATIV

det är viktigt att säkerställa fotosäkerheten hos kemikalier när det finns risk för exponering för människor, vilket tydligt kan exemplifieras av läkemedel (20) eller kosmetika (21). För att utvärdera potentialen för fototoxicitet hos en kemikalie har olika testmetoder som sträcker sig från in silico(22), i chemico(23), in vitro till in vivo-analys införts. I chemico-analyser som ROS generation (24), in vitro-test som inkluderar 3T3 NRU-analys och 3D-epidermismodell och in vivo-studier som använder marsvin, mus eller pigmenterade råttor har utvecklats och rutinmässigt använts (25).

ljuskälla för fototoxicitet. Ljuskälla för fototoxicitet är extremt viktig eftersom våglängder som absorberas av testkemikalien (absorptionsspektrum) och ljusdosen (som kan uppnås inom rimlig exponeringstid) bör vara tillräckliga för att inducera fototoxicitet (26). Solsimulatorer som simulerar naturligt solljus anses vara den perfekta konstgjorda ljuskällan (Fig. 5).

strålningskraftfördelningen för den filtrerade solsimulatorn bör vara nära den för dagsljus utomhus. Solsimulatorer är utrustade med xenonbågar eller (dopade) kvicksilver-metallhalogenbågar. De bör också lämpligen filtreras för att dämpa de mycket cytotoxiska UVB-våglängderna. Spektrumet som registreras under dessa filter bör inte avvika från standardiserat utomhus dagsljus (Specifikation: FDA CFR Part 201.327, ISO 24444:2010(E), CIE-85-1989).

ändå kan annan UVA-ljuskälla som UVA-lampa också användas med en korrekt UV-dosimeter för att kontrollera intensiteten och våglängden. Ljusintensiteten (bestrålning) varierar beroende på källorna, och det bör kontrolleras regelbundet före varje fototoxicitetstest med hjälp av en lämplig bredband UV-mätare. UV-mätaren måste ha kalibrerats före varje mätning. Följaktligen beror bestrålningstiden på intensiteten hos ljuskällan (t.ex. för 1,7 mW/cm2 ljuskälla är 50 min exponeringstid nödvändig för att uppnå 5 J/cm2). Bestrålningstiden varierar också beroende på testmetoderna. En dos på 5 J / cm2 (mätt i UVA-intervallet) bestämdes vara icke-cytotoxisk men tillräckligt potent för att excitera kemikalier för att framkalla fototoxiska reaktioner i 3T3 Neutral röd upptagningsanalys.

3T3 Neutral röd upptagningsanalys. 3T3 NRU-analys har officiellt godkänts av OECD och godkänts som OECD TG432 i 13th April 2004 (3). Detta test utvärderar fotocytotoxicitet genom att bestämma den relativa minskningen av cellviabilitet efter exponering för testartikeln i närvaro mot frånvaro av UV/VIS-bestrålning. Beslut att genomföra 3T3 NRU fototoxicitetstest görs för de kemikalier som visar absorptionsspektra i UV/VIS-regionen när de löses i lämpligt lösningsmedel (17). Det har föreslagits att om den molära utrotnings−/absorptionskoefficienten är mindre än 10 liter X mol−1 x cm-1 är det osannolikt att kemikalien är fotoreaktiv (t.ex. i UV-kyvett med 1 cm lång Ljusväg ska OD på 0,05 m lösning vara mindre än 0,5 för att betraktas som icke-fotoreaktiv baserat på ekvationen ”absorbans = utrotningskoefficient x banlängd x koncentration”) (26). 3T3 NRU-test uppvisar mycket känslig men låg specifik prediktiv kapacitet (en känslighet på 93% och en specificitet på 84%). 3T3 NRU-test har många begränsningar. Det kan inte förutsäga andra biverkningar än foto(cyto)toxicitet som kan uppstå genom kombinerad verkan av en kemikalie och ljus såsom fotogenotoxicitet, fotoallergi (fotosensibilisering) eller fotokarcinogenicitet. 3T3 NRU-test används endast för faroidentifiering medan dess användbarhet för bedömning av fototoxisk potens inte är motiverad.I synnerhet saknar detta analyssystem metabolisk aktivitet som är kritisk vid manifestationen av systemiskt exponerade kemikalier. För systemiskt exponerade kemikalier som kräver metabolisk aktivering som monokrotalin, riddelliin och heliotrin (pyrrolizidinalkaloider) (28) rekommenderas därför djurstudier in vivo (5,29).

grundläggande testprincip för 3T3 NRU är jämförelsen av cellviabilitet i närvaro eller frånvaro av UV/Vis-bestrålning, bestämd med vital färgämne, neutralt rött, vilket är ett svagt katjoniskt färgämne som lätt tränger igenom cellmembran och ackumuleras intracellulärt i lysosomer av livskraftiga celler. Bascellslinjen är Balb / c 3T3 cell, som är musfibroblast utvecklad från musembryon av G. T. Todaro 1968. 3T3-beteckningen står för ”3-dagars överföring, inokulum 3 msk 105-celler” i 20 cm2-skålen, och denna cell är relativt stabil, lättillgänglig och lätt att hantera (30). Dermal fibroblast är en av målceller för fototoxicitet som ger en fast motivering för anställning av 3T3-celler.

för att avgöra om testartikeln är fototoxisk eller inte i 3T3 NRU-analys ska koncentrationssvaret erhållas i närvaro och i frånvaro av bestrålning. Fotoirritationsfaktor (PIF) eller genomsnittlig fotoeffekt (MPE) ska beräknas (31). PIF är förhållandet mellan IC50 (koncentration som minskar cellens livskraft med 50%) av icke-bestrålade över bestrålade som visas i Fig. 7.

Prediktionsmodell för Fotocytotoxicitet med PIF (Fotoirritationsfaktor).

när IC50 inte kan erhållas beräknas MPE enligt följande ekvation

PIF < 2 eller en MPE < 0.1 förutsäger: ”ingen fototoxicitet”. En PIF > 2 och < 5 eller en MPE > 0,1 och < 0,15 förutsäger: ”sannolik fototoxicitet” och PIF > 5 eller en MPE > 0,15 förutsäger: ”fototoxicitet” (Fig. 8).

Fotoeffektberäkning: fotoeffekten (PEC) vid en godtycklig koncentration C definieras som produkten av svarseffekten (REC) och doseffekten (DEC), dvs PEC = REC XHamster DEC. Definitionen illustreras som antagen från (31). Beräkning av fotoeffekten vid koncentrationen 0,4 följer ekvationerna i texten ger: svarseffekt RE0.4 = (66% − 11%)/100% = 0.55, dos effekt DE0.4 = (0.4/0.16 − 1)/(0.4/0.16 + 1) = 0.43, och fotoeffekt PE0. 4 = 0.24. Den genomsnittliga fotoeffekten erhålls genom medelvärde över värdena för fotoeffekten vid olika koncentrationer (31).

erytrocyt hemolystest. Cellmembran är sårbara för fotokemiskt genererade ROS och radikaler. UVA-inducerad skada av erytrocyt och resulterande hemolys (fotohemolys)aktiveras för att bedöma fototoxisk potential hos testartiklar (32). Fårröda blodkroppar (SRBC) inkuberas med kemikalier och bestrålas med UVA vid 20 J/cm2. Efter bestrålning inkuberades Srbc i mörkret under 2 timmar vid rumstemperatur och sedan under ytterligare 1 timme vid 37 kcal, varefter hemolys mättes med Drabkins reagens och mätningen av UV-absorbans vid 540 nm. Omfattningen av fototoxicitet bedömdes genom frisättning av hemoglobin från SRBC, dvs fotohemolytisk aktivitetsom följer ekvation (33).

• ade: optisk densitet av exponerad läkemedelslösning med erytrocyter

• AD: optisk densitet av exponerad läkemedelslösning utan erytrocyter

• C: optisk densitet av 100% hemolytisk kontrolllösning

Fototoxicants gillar ciprofloxacin, norfloxacin eller Enoxacin förhöjer photohemolytic aktivitet markant över 20% på 100 occurg/mL. Känsligheten, specificiteten och noggrannheten i detta test var 67%, 73% respektive 73% för 24 kemikalier (8 dofter, 5 UV-absorberare, 4 läkemedel, 4 antimikrobiella medel och 3 färgämnen) jämfört med in vivo marsvinstest (34). Låg känslighet kan vara problematisk och dess prestanda är mycket sämre än 3T3 NRU-testet, vilket kan förklara den minskade användningen av detta test nyligen.

in vitro human 3D epidermis modell. För att övervinna begränsningarna av in vitro-cellbaserade metoder undersöks 3D-rekonstruerad epidermismodell för applicering på fototoxicitetstester (35,36). I grund och botten liknar testprincipen 3T3 NRU-test, nämligen bedömningen av skillnaden i vävnadsviabilitet mellan i närvaro och frånvaro av UV/VIS-bestrålning. Liknande prediktionsmodell som använder PIF och MPE kan användas (37). I 3D-epidermismodell kan emellertid vattenolösliga material testas och en viss grad av metabolisk kapacitet bevaras i de primära keratinocyterna i epidermalskiktet som kan appliceras på de toxiska ämnena som kräver metabolisk aktivering (38). Dessutom är mätning av cytokinproduktion som IL-1 kg (Interleukin-1 kg) (39), kometanalys (40) och histologisk undersökning möjlig som kan övervägas vid ytterligare utvärdering av fotoallergenicitet och fotokarcinogenecitet.

in vivo metoder som använder marsvin, mus eller pigmenterade råttor. Laboratoriedjur som möss och marsvin används för att simulera verkliga scenarier för mänsklig fototoxicitet. Djur utsätts för kemikalier lokalt eller systemiskt och bestrålas med lämplig dos UVA (vanligtvis 10 J/cm2 för marsvinsprovet, 20 J/cm2 för musprov (41)). Scoring av erytem och ödem från 0 till 4 summeras och maximal poäng under 72 timmars observation är i genomsnitt per djur för att generera irritationsindex. Fototoxicitetsindex erhålls genom ekvationen” Irritationsindex för UVA-bestrålat Irritationsindex för icke – bestrålat ställe ” (42). Fototoxicitetsindex över 0,6 indikerar potentialen för fototoxicitet. Alternativt kan örontjockleken mätas för att uppskatta ödem i musprov. Dessa in vivo-tester återspeglar väl den patofysiologiska processen för fototoxicitet hos människor men uppoffringar av djur, utgifter och tid som krävs för att genomföra testet utgör många problem, särskilt i en tid präglad av bred medvetenhet om djurskydd och etik. Icke-djurbaserade fototoxicitetstester får popularitet idag för att övervinna dessa problem (43).

i kemiska metoder för fototoxicitetsutvärdering. Cellfria provrörsmetoder, nämligen i chemico har undersökts för att bedöma fototoxicitet. Information om ljusabsorbans och fotostabilitet hos testartikeln har analyserats för att förutsäga fototoxicitet (44). Med hjälp av genereringen av reaktiva syrearter under fotoexcitation och efterföljande fotoreaktion kan fototoxisk potential hos en kemikalie utvärderas i chemico(12). Singlet syre detekteras genom p-nitrosodimetylanilin (RNO) blekning medan Nitro Blue-Tetrazolium Test (NBT-formazan reaktion) används för att bestämma peroxidgenerering som avbildas nedan (24),

• Singlet syre + imidazol

• → → oxiderad imidazol

• + RNO

• → RNO blekning + produkter

ROS generation analys uppvisade känslighet och specificitet av 90% och 76.9% för kosmetika och 100% och 75% för icke-kosmetiska kemikalier. DNA-strängbrytningsaktivitet är ett annat sätt att utvärdera UV-inducerad fototoxicitet av olika typer av kemikalier, eller läkemedel i chemico genom att kvantifiera öppet eller slutet cirkulärt DNA. Denna analys kräver inte heller levande celler eller vävnader, utan plasmid. Plasmid löses i buffert och blandas med testartiklar. Efter att blandningen har bestrålats med UV utsätts proverna för elektrofores. Mängden brott DNA analyseras med fluorescerande baserad teknik. UV-inducerad fototoxisk förening resulterar i att DNA-strängar öppnas och det är beroende av läkemedelskoncentration och UV-bestrålningsdos (33). Dessa tester kräver inte levande celler eller vävnader som kan öka variationen i testresultaten. Dessa metoder har emellertid begränsningar som inkluderar brist på metabolisk aktiveringskapacitet, oanvändbarhet av vattenolösliga material (oljor, fasta ämnen, geler, formulerade produkter) och oförmåga att förutsäga fotogenotoxicitet, fotoallergi(fotosensibilisering) eller fotokarcinogenicitet. Detta test är begränsat till faroidentifiering, inte för en bedömning av fototoxisk potens.