2-D elektroforéza začíná elektroforézy v prvním rozměru a pak odděluje molekuly kolmo od první k vytvoření elektroforeogramu v druhé dimenzi. Při elektroforéze v první dimenzi jsou molekuly odděleny lineárně podle jejich izoelektrického bodu. Ve druhé dimenzi se pak molekuly oddělí při 90 stupních od prvního elektroferogramu podle molekulové hmotnosti. Protože je nepravděpodobné, že dvě molekuly budou podobné ve dvou odlišných vlastnostech, molekuly jsou účinněji odděleny v 2 – D elektroforéze než v 1-D elektroforéze.
dvě dimenze, na které jsou proteiny rozděleny pomocí této techniky, mohou být izoelektrický bod, hmotnost proteinového komplexu v nativním stavu nebo hmotnost proteinu.
separace proteinů izoelektrickým bodem se nazývá izoelektrická zaostřování (IEF). Tím se na gel aplikuje gradient pH a přes gel se aplikuje elektrický potenciál, takže jeden konec je pozitivnější než druhý. Při všech hodnotách pH jiných než jejich izoelektrických bodech budou proteiny nabíjeny. Pokud jsou kladně nabité, budou tažena směrem k více negativní konec gelu a pokud jsou negativně nabité budou vytáhl na více pozitivní konec gelu. Proteiny aplikované v první dimenzi se budou pohybovat podél gelu a budou se hromadit v jejich izoelektrickém bodě; to znamená, že bod, ve kterém je celkový náboj na proteinu 0 (neutrální náboj).
pro analýzu fungování proteinů v buňce je nezbytná znalost jejich spolupráce. Nejčastěji proteiny působí společně v komplexech, aby byly plně funkční. Analýza této suborganické organizace buňky vyžaduje techniky zachování přirozeného stavu proteinových komplexů. Při nativní elektroforéze polyakrylamidového gelu (native PAGE) zůstávají proteiny ve svém přirozeném stavu a jsou odděleny v elektrickém poli po jejich hmotnosti a hmotnosti jejich komplexů. Chcete-li získat separace podle velikosti a ne náboj, jako v IEF, příplatek je převedena do proteinů pomocí Coomassie Brilliant Blue nebo lithium dodecyl sulfát. Po dokončení první dimenze jsou komplexy zničeny aplikací denaturační SDS-stránky ve druhé dimenzi, kde proteiny, z nichž jsou komplexy složeny, jsou odděleny svou hmotností.
před oddělením proteinů hmotou se ošetřují dodecylsulfátem sodným (SDS) spolu s dalšími činidly (SDS-PAGE v 1-D). To denaturuje proteiny (to znamená, že je rozkládá na dlouhé, přímé molekuly) a váže řadu molekul SDS zhruba úměrných délce proteinu. Protože protein je délka (v rozloženém stavu) je zhruba úměrná jeho hmotnosti, toto je ekvivalent k říkat, že to se váže několik molekul SDS zhruba úměrná proteinové hmotnosti. Vzhledem k tomu, že molekuly SDS jsou záporně nabité, výsledkem toho je, že všechny proteiny budou mít přibližně stejný poměr hmotnosti k náboji jako každý jiný. Kromě toho, proteiny nebude stěhovat, když nemají žádné starosti (výsledek isoelektrická fokusace krok) proto povlaku proteinu v SDS (záporně nabité) umožňuje migraci bílkovin v druhý rozměr (SDS-PAGE, není kompatibilní pro použití v prvním rozměru, jak je nabitá a neionogenní nebo zwitterionic pracího prostředku musí být použity).V druhé dimenzi, elektrický potenciál je znovu použít, ale v úhlu 90 stupňů od prvního pole. Proteiny budou přitahovány k pozitivnější straně gelu (protože SDS je záporně nabitý) úměrně k jejich poměru hmotnosti k náboji. Jak již bylo vysvětleno, tento poměr bude téměř stejný pro všechny proteiny. Pokrok proteinů bude zpomalen třecími silami. Gel proto působí jako molekulární síto, když proud je aplikován, odděluje proteiny na základě jejich molekulové hmotnosti větších proteinů byl zachován vyšší v gelu a menší proteiny schopen projít přes sítko a dostat se spodní části gelu.