Gelové Filtrační Chromatografie

Gelové Filtrační Chromatografie Aplikace

Gelové filtrační chromatografie, typ velikost vyloučení chromatografie, může být použit buď fractionate molekul a komplexů ve vzorku do frakcí s konkrétním rozmezí velikosti, odstranit všechny molekuly větší než určité velikosti ze vzorku, nebo kombinace obou operací. Gelová filtrační chromatografie může být použita k oddělení sloučenin, jako jsou malé molekuly, proteiny, proteinové komplexy, polysacharidy a nukleové kyseliny ve vodném roztoku. Když se jako mobilní fáze použije organické rozpouštědlo, proces se místo toho označuje jako gelová permeační chromatografie.

gelová filtrační chromatografie může být také použita pro:

• Frakcionací molekuly a komplexy v předem stanoveném rozmezí velikosti
• Velikost analýza a stanovení
• Odstranění velké proteiny a komplexy
• výměna Buffer
• Odsolování
• Odstranění malých molekul, jako jsou nukleotidy, primery, barviva, a kontaminujících látek
• Hodnocení čistoty vzorku
• Oddělení vázán od nevázaného radioizotopů

Gelové filtrační chromatografie média pro všechny výše uvedené použití jsou k dispozici v balené gravitace tok sloupců, spin sloupce, nízký tlak a středotlaké chromatografické kolony a lahvové pryskyřice.

Gelové Filtrační Chromatografie Mechanismus

V gelové filtrační chromatografii kolony, stacionární fáze se skládá z porézní matrice, a mobilní fáze je vyrovnávací paměť, která proudí v mezi matrix korálky. Kuličky mají definovaný rozsah velikosti pórů, známý jako rozsah frakcionace. Molekuly a komplexy, které jsou příliš velké pro vstup do pórů, zůstávají v mobilní fázi a pohybují se kolonou s proudem pufru. Menší molekuly a komplexy, které se mohou pohybovat do pórů, vstupují do stacionární fáze a pohybují se gelovou filtrační kolonou delší cestou přes póry kuliček.

Nějaké molekuly nebo komplexní, že je nad frakcionační rozsah pro konkrétní gelová filtrace, chromatografie na sloupec se bude pohybovat přes kolony rychleji, než jakékoliv molekuly, které mohou vstoupit do stacionární fáze. Proto jakékoliv složky ve vzorku, které je nad frakcionační rozsah bude eluovat jako první (v prázdnotě objemu), než něco, co je v frakcionační rozsah. Minimální velikost, která zůstane v mobilní fázi a nevstoupí do stacionární fáze, se nazývá limit vyloučení. Bio-Rad nabízí gelová filtrační chromatografická média a kolony s vylučovacími limity v rozsahu přes tři řády, od 100 daltonů do 100 000 daltonů (100 kDa).

molekuly a komplexy, které mohou vstoupit do stacionární fáze, budou frakcionovány podle jejich velikostí. Menší molekuly se bude stěhovat hluboko do pórů a bude retardovaný více než větší molekuly, které nejsou tak snadno vstupují do pórů a jsou tak eluovány z kolony rychleji. Tento rozdíl v migraci pórů vede k frakcionaci složek podle velikosti s největším elutováním jako první.

V gelové filtrační chromatografii určený pro odsolování, výměna buffer, a odstranění malých molekul, jako jsou nukleotidy, soli a malé sloučenin snadno vstoupit do pórů, jsou retardované, a migrovat pomaleji projít kolonou, než větší proteiny nebo nukleové kyseliny. Proto jsou složky zájmu ve vzorku eluovány předem solí, nukleotidů atd. Dna vyčištění soupravy pomocí tohoto mechanismu často obsahují gel filtrace spin kolony.

rozlišení, zde definované jako ostrost hranic mezi velikostními frakcemi, je určeno velikostí perliček a řadou dalších faktorů. Menší velikost kuliček obecně poskytuje vyšší rozlišení ve sloupci gelové filtrační chromatografie. Kompaktní molekuly difundují stacionární fází rychleji než lineární molekuly. Velikost vyloučení, frakcionační rozsah, a eluční sazby jsou ovlivněny složení pufru, iontové síle a pH. Pro dělení komplexních směsí bílkovin, eluční časy a velikosti vyloučení limity mohou třeba určit empiricky.

Gelové Filtrační Chromatografie Média

důležitým kritériem pro gelové filtrační chromatografie médií je, že média je inertní a to nic ve vzorku nebo žádnou vyrovnávací paměti se váže k médiím. Dalším aspektem je typ gelové filtrace sloupec používán a zda je používá v přetlakové chromatografie systému nebo gravitační tok nebo spin columns. Pokud se používá tlakový chromatografický systém, kolona i médium musí být schopny tolerovat použitý tlak a průtok.

Běžně používané médium pro gelové filtrační chromatografie jsou založeny na agarózovém nebo polyakrylamidovém korálky, dextróza pro gravitační nebo nízkotlaké systémy a polymerní pryskyřice pro středotlaké systémy. Volba média závisí na vlastnostech složek, které mají být odděleny, a na dalších experimentálních faktorech. Níže jsou uvedeny obecné úvahy při určování volby gelového filtračního chromatografického média:

• Frakční rozpětí
• Size exclusion limit
• Provozní tlak
• Průtok
• Vzorek viskozita
• pH
• Autoclavability
• Tolerance pro vodou mísitelná organická rozpouštědla, některé vzorky může být více rozpustné ve vodě-organické mix
• Tolerance pro detergenty, chaotropic agenti, formamid, atd.
• pracovní teplota

typy vzorků, výběr médií, a chromatografie nastavení systému určí, které parametry jsou nejdůležitější pro daný čištění aplikace.