Výsledky a Diskuse
PCR-RFLP analýza odhalila omezení vzory kompatibilní s in silico analýzy. Všichni psi s malformací ocasu vykazovali stejný vzor (3 fragmenty, 2 viditelné pásy), který se lišil od vzoru psů s normálním ocasem (2 fragmenty, 1 viditelný pás) (obr.1). Další test, také na základě PCR-RFLP, byl úspěšně použit k identifikaci stejnou mutaci v T genu psů, ale pomocí polyakrylamidové gelové elektroforézy systém (Gruszczynska & Czapla 2011). Výkon elektroforézy polyakrylamidového gelu by mohl zlepšit rozlišení pásů vzhledem k fragmentům DNA v této studii. Praktičnost by se však snížila, protože tento systém je pracnější. V této studii, i když nebylo možné vizualizovat všechny fragmenty DNA generované po trávení, bylo možné snadno rozlišit genotypy pomocí elektroforézy agarózového gelu.
obr.1. PCR-RFLP pro detekci mutace C189G. Marker základních párů (M), postižených psů-krátký ocas (1-7) a zvíře s normálním ocasem (8).
při analýze sekvenovaných vzorků byla heterozygotnost C (cytosin) G (guanin) pozorována v nukleotidu 189 exonu 1 pouze u psů s malformací ocasu. Umístění mutace bylo založeno na sekvenci mRNA genu t Dostupné v Genbank (přístupové číslo: AJ245513).
při analýze in silico byla také pozorována změna aminokyseliny 63 z isoleucinu na methionin. Všechny sekvence DNA, získané v této studii byla uložena v Genbank pod přístupovými čísly: MF495488 (krátký ocas), MF495489 (absence ocasu), MF495490 (absence ocasu) a MF495491 (normální ocas).
ačkoli byl nalezen pouze jeden genotyp pro současný stav (CG pro zvířata s malformací ocasu), u postižených psů byla pozorována fenotypová variace, což je velikost ocasu. Některá zvířata vykazovala krátký ocas (přibližně 3-4 obratle) a jiná vykazovala nepřítomnost ocasu (přibližně 1-2 obratle) (obr.2). Podobné fenotypy byly také pozorovány Haworth et al. (2001) u psů. Ačkoli vysvětlení pro toto není dosud známo u psů, Buckingham et al. (2013), studium vrozené změny velikosti ocasu u koček, našel důkaz haploinsufficience způsobené více mutacemi v t genu. C.1199delC, c.1169delC a c. 998delT mutace byly spojeny s různými úrovněmi genové exprese, což by mohlo vysvětlit různé fenotypy u psů s malformací ocasu (Buckingham et al . 2013).
obr.2. A) pes nesoucí mutaci C189G v t genu. B) pes ze stejného vrhu bez mutace C189G.
dědičný charakter mutace lze prokázat analýzou heredogramu (obr.3) studovaného vrhu. Bylo možné ověřit, že mutace má autozomálně dominantní dědičnost. V této studii však nebyl nalezen žádný dominantní homozygotní (GG) genotyp, což posiluje pozorování, že při homozygóze mutovaný t gen způsobuje smrt plodu (Haworth et al . 2001). Hytonen et al. (2009) pozorovali, že vrhy z křížení mezi normální-tailed zvířata (CC genotyp) bylo 29% větší než vrhy z křížení mezi chybně ocas zvířat (CG genotyp). Tento výsledek je slučitelný s očekávaným snížením o 25% u potomků z křížení zahrnujících letální alely.
obr.3. Heredogram ukazující dědičný vzor mutace c189g v t genu labradorského retrívra. Křížení mezi prarodiči matky (I), vrh postiženého psa a jeho křížení s normálním samcem (II) a analyzovaným vrhem (III).
mutace v t genu byly spojeny s malformací ocasu u jiných druhů, jako jsou myši a kočky (Wilson et al. 1995, Buckingham a kol. 2013). A v některých z nich jsou pozorovány i další změny, jako je močová a fekální inkontinence u koček (Robinson 1993). U psů však byla dosud pozorována pouze malformace ocasu u heterozygotních zvířat(CG) (Indrebo et al. 2008). I když v některých psích plemen na „ocas malformace“ fenotyp nebylo spojeno s C189G mutace (Boston Teriér, anglický Buldok, King Charles Španěl, Knírač, Parson Russell Teriér a Rotvajler), velký počet plemen postižené naznačuje, prastaré mutace (Hytonen et al. 2009), který je přítomen u psů předků před vznikem mnoha plemen. Nicméně, interracial křížení může také přispět k difúzi mutace, protože heterozygotní zvířata CG zřejmě nemají žádné změny libida nebo reprodukčního výkonu. Dalším faktorem, který mohl přispět k difúzi mutací, bylo použití při reprodukci psů bez ocasu, kdy byla stále povolena estetická kaudektomie. V tomto období, je pravděpodobné, že mnoho zvířat s agenezí ocasu bylo použito jako reproduktoři, protože u některých plemen byla žádoucí absence ocasu, přispívající k difúzi mutací.
v Současné době, praxe caudectomy (chirurgické ocas odstranění) je zakázáno postup v několika zemích světa, jako jsou ty, Evropské Unie a Brazílie (Haworth et al. 2001, CFMV 2013). V některých zemích Evropské Unie, genetické testy k identifikaci C189G mutace v T genu se používají k ověření, zda absence ocasu u některých plemen je vrozená původu nebo zvířata podstoupila nelegální chirurgický zákrok. PCR-RFLP použitý v této studii byl jednoduchou a přesnou technikou k identifikaci této mutace a mohl být použit jako důkaz k identifikaci nelegální praxe kaudektomie.
Vzhledem k nedostatku informací o C189G mutace v T genu psů, nemáme žádné další informace o jeho spojení s jinými morfologické nebo i fyziologické znaky, a proto musí být zkoumána.