podobný genetický kód používá většina organismů na Zemi, ale různé organismy mají různé preference pro kodony, které používají kódování specifické aminokyseliny. To je možné, protože v každém kodonu jsou 4 báze (a, T, C A G) a 3 pozice. Proto existuje 64 možných kodonů a jen 20 aminokyselin a 3 stop kodony pro enkódování odchodu kodonech 41 nezvěstných. Výsledkem je redundance; více kodonů kóduje jednotlivé aminokyseliny. Evoluční omezení formovala, které kodony se používají přednostně, ve kterých organismy-organismy mají zkreslení používání kodonů.
můžete najít mnoho kodonu tabulky zobrazující, které kodony kódují které aminokyseliny (viz příklad vpravo). S těmito jednoduchých pravidel, možná si myslíte, že je snadné přijít s funkční sekvence DNA pro přípravu peptidů zájmů a produkovat peptid v organismu volby. Bohužel, předvolby kodonu to dělají, takže si nemůžete vybrat mezi možnými kodony náhodně a očekávat, že se vaše sekvence dobře projeví v jakémkoli organismu.
jaká jsou tedy evoluční omezení, která vedou k těmto preferencím a co s nimi můžeme dělat? Čtěte dále a zjistěte to!
proč mají organismy různé zkreslení při používání kodonů?
důvody různých preferencí kodonů mezi organismy nejsou zcela pochopeny, ale některé možné důvody zahrnují:
- Metabolické tlaky – to trvá buněčné zdroje k výrobě tRNAs, že rozpoznat různé kodony, upravit tRNAs správně, a účtovat tRNAs s odpovídající aminokyseliny. Pokud organismus používá pouze podmnožinu kodonů, potřebuje pouze vytvořit podmnožinu nabitých tRNA, a proto může potřebovat méně zdrojů pro celý translační proces. Například, při vysoké tempo růstu podmínky, E. coli přednostně upreguluje výroby tRNAs, že rozpoznat kodony našel ve vysoce vyjádřil geny (Emilsson a Kurland, 1990).
- Ovládající genové exprese prostřednictvím genové sekvence – Proteiny, které jsou kódovány pomocí kodonů s nízkými hojnosti nebo špatně účtovány tRNAs mohou být vyrobeny v menší míře než proteiny kódované velmi hojný, nabitá tRNAs. Například Tuller et al. zjistil, že překlad účinnost je dobře koreluje s codon bias jak v E. coli a S. cerevisiae.
- skládání proteinů-pokud je protein kódován směsí kodonů s vysoce a špatně nabitými tRNA, mohou být různé oblasti proteinu překládány různými rychlostmi. Ribozom se bude rychle pohybovat po regionech vyžadujících hojnost, nabité tRNA, ale zastaví se v regionech vyžadujících nízkou hojnost, špatně nabité tRNA. Když se ribozom zastaví, může to dát rychle přeloženým regionům šanci správně složit. Například Pechmann a Frydman zjištěno, že plochy non-optimální kodony jsou spojeny s konkrétní sekundárních struktur v 10 blízce příbuzné kmeny kvasinek.
- adaptace na měnící se podmínky-organismy často potřebují exprimovat geny na různých úrovních za různých podmínek. S pestrou kodonu využití, organismus se může změnit, které proteiny jsou vysoce vyjádřeny a které jsou špatně vyjádřil tím, že produkuje a nabíjení specifické tRNA bazény. Například, tRNAs používá v genech kódující aminokyseliny biosyntetické enzymy mohou být přednostně nabité během aminokyselin hladovění, což vede k vyšší produkci aminokyselin biosyntetické enzymy (Dittmar et al., 2005).
jak ovlivňuje zkreslení používání kodonu mé experimenty?
Zatímco kodonu preference mohou být velmi užitečné pro organismy, které mohou být problematické pro výzkumníci se snaží vyjádřit proteinů v heterologních hostitelů. Pokud si prostě amplifikaci genu zájmu od lidského genomu, například, může to vyjádřit v E. coli (můžete najít řadu databází ukazuje různé organismy‘ kodon preference on-line). I když je gen přeložen, nemusí fungovat správně. Je to důsledek nesouladu mezi preferencí kodonu člověka a E. coli. Některé kodony běžně používané u lidí nejsou u E. coli vůbec běžné a naopak. Při překládání těchto kodonů, ribozomu proto může stánku na nevhodných místech, nebo nepodaří, aby se to přes celý přepis což má za následek produkci nefunkční proteiny a proteinové fragmenty, resp.
Řešení problému codon usage bias – kodon optimalizace a vyjádření alternativních tRNAs
Kodon optimalizace
S nízkými náklady syntézu DNA, jeden z primárních způsobů, jak vědci vyřešit problém kodonu volba je resynthesize geny tak, že jejich kodony jsou vhodnější pro požadovaný výraz hostitele. Toto je známé jako “ optimalizace kodonu.“Ačkoli teoreticky jednoduché, není to tak snadné, jak to zní. I pro relativně krátké peptidy může existovat mnoho možných způsobů, jak je kódovat, a to, co tvoří „vhodný“ kodon, není nutně zřejmé.
můžete si myslet: „nesmysl! Měl bych jen vybrat kodonu s nejhojnější bazén nabitých tRNAs v mém hostitelském organismu pro každou aminokyselinu rád bych kódovat,“ ale, jak je popsáno výše, ne každý region proteinu by měly nutně být přeloženy rychle produkovat protein, který funguje správně.
můžete si pak myslet: „dobře, jen se ujistím, že množství kodonů, které jsem si vybral pro hostitele, odpovídá množství kodonů používaných v původním organismu.“To je možná lepší nápad a byl úspěšně použit v minulosti (Angov et al ., 2008), ale při navrhování plného genu je třeba zvážit ještě mnoho dalších funkcí. Neúplný seznam obsahuje:
- Kodon hojnosti vzhledem k analogickým hojnost tRNA
- Opakující se sekvence
- Restrikční místa
- Sekvence náchylné k vytvoření sekundárních struktur v RNA přepisy
- vliv na transkripci (pamatujte si, že to není jen o překladu – např. kodonu volba může přerušit transkripční faktor vazebná místa)
Jak jste si možná představit, to není snadné pro lidi, aby vyvážit všechny tyto faktory na jejich vlastní. Naštěstí mnozí vědci vytvořili kodonu optimalizace algoritmů a syntézu DNA společnosti jako IDT a GenScript host on-line kodonu optimalizační nástroje. Mějte na paměti, že jen proto, že jste optimalizovat genu s jedním z těchto nástrojů, nutně to neznamená, že gen je vyjádřit. Pokud získáte dobrý výraz, měli byste také funkčně analyzovat produkovaný protein, abyste se ujistili, že se správně složil.
můžete se vyhnout optimalizaci vašich genů, které Vás zajímají, objednáním plazmidů obsahujících je z Addgene. Pokud plasmid v Addgene obsahuje gen, který byl optimalizován pro určitý organismus, bude to někdy (ale ne vždy) zaznamenáno v poli „mutace“ na stránce plasmid (viz například plasmid 87904). Jako mnoho plazmidů dostupné z Addgene nyní máte plnou sekvence dat, doporučujeme přímo analýze sekvencí genu pro bílkovinu optimalizace a vhodnosti pro výraz hostitele před jejich použitím ve vašich experimentů.
Vyjádření alternativních tRNAs
Pokud nemáte čas nebo prostředky, aby syntetizovat kodonu optimalizované verzi genu zájmu, je možné overexpress nízké množství tRNAs ve svém projevu hostitele, a tím zvýšit jejich množství. Například komerční kmeny Rosetta E. coli exprimují různé tRNA, které se běžně vyskytují v nízké hojnosti E. coli.
výhodou výroby dalších tRNA je to, že můžete použít stejný systém exprese pro mnoho různých genů, aniž byste museli vytvářet nové konstrukce. Nicméně, vzhledem k problémům, jako jsou neodpovídající překlad sazby a potenciální účinky na růst buněk, dokonce i hostitelé vyrábějící alternativní tRNAs nemusí vyjádřit dostatečné množství bílkovin zájmu.
bez Ohledu na to, který způsob si vyberete, jak překonat problémy kolem kodonu výběr, měli byste mít nějaký způsob, aby se ujistil, proteiny produkovat správně fungovat. Zvýšená exprese může vést k tvorbě nerozpustné, nefunkční kapičky bílkovin, známé jako zařazení subjektů, které se obecně oddělit s buněčnou peletu během čištění postupů. I pokud jste produkovat velké množství bílkovin ve svém projevu hostitele volby, měli byste provést funkční test, aby se ujistil, vaše bílkovin není tvořit začleňování subjektů a je skládací správně.
1. Angov, Evelina a kol. „Heterologní exprese proteinu je zvýšena harmonizací frekvencí využití kodonu cílového genu s frekvencemi expresního hostitele.“PloS one 3.5 (2008): e2189. PubMed PMID: 18478103. PubMed centrální PMCID: PMC2364656.
2. Dittmar, Kimberly A., et al. „Selektivní nabíjení izoakceptorů tRNA indukovaných hladem aminokyselin.“Embo reports 6.2 (2005): 151-157. PubMed PMID: 15678157. PubMed centrální PMCID: PMC1299251.
3. Emilsson, Valur a Charles G.Kurland. „Závislost rychlosti růstu hojnosti přenosové RNA u Escherichia coli.“The Embo journal 9.13 (1990): 4359-4366. PubMed PMID: 2265611. PubMed centrální PMCID: PMC552224.
4. Gustafsson, Claes, Sridhar Govindarajan a Jeremy Minshull. „Kodon bias a heterologní exprese proteinu.“Trendy v biotechnologii 22.7 (2004): 346-353. PubMed PMID: 15245907.
5. Maertens, Barbara a kol. „Mechanismy optimalizace genů: multigenová studie odhaluje vysokou úspěšnost lidských proteinů v plné délce exprimovaných v Escherichia coli.“Protein Science 19.7 (2010): 1312-1326. PubMed PMID: 20506237. PubMed centrální PMCID: PMC2970903.
6. Pechmannová, Sebastian a Judith Frydmanová. „Evoluční zachování optimality kodonu odhaluje skryté podpisy cotranslačního skládání.“Nature structural & molecular biology20. 2 (2013): 237. PubMed PMID: 23262490. PubMed centrální PMCID: PMC3565066.
7. Quax, Tessa EF, et al. „Kodon bias jako prostředek k jemnému doladění genové exprese.“Molecular cell 59.2 (2015): 149-161. PubMed PMID: 26186290. PubMed centrální PMCID: PMC4794256.
- tato recenze poskytuje skvělý přehled o zkreslení používání kodonů
8. Tuller, Tamir a kol. „Účinnost překladu je určena jak předpětí kodonu, tak skládací energií.“Sborník Národní akademie věd 107.8 (2010): 3645-3650. PubMed PMID: 20133581. PubMed centrální PMCID: PMC2840511.