1 Úvod
Geny pro transmembránové proteiny (TMPs) tvoří 20-30% většina genomů (Wallin & Heijne, 1998), a na základě jejich zásadní role v buněčné fyziologii, TMPs jsou cíle velké frakce klinicky užitečné léky. Určení jejich struktur a způsobů působení má tedy značný význam. Počet dostupných TMP struktur s vysokým rozlišením však zůstává relativně nízký (viz webová stránka Stephena Whitea; http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/). Dvě vysvětlení, které jsou často používány po obtížnost získání no-difrakcí krystaly TMPs pro použití v X-ray difrakční studie (1) TMPs jsou strukturálně dynamické s flexibilní regiony, které dělají to obtížný pro protein přijmout jednotné konformace nutné pro balení do křišťálové; a (2) povrchy transmembránové oblasti TMPs neúčastní stejně snadno jako plochy kulové rozpustných bílkovin v protein–protein interakcích, které jsou nutné pro crystal balení. Představujeme stabilní rozpustné bílkoviny na povrchu exponované oblasti TMP poskytuje způsob, jak potenciálně obcházení oba tyto problémy, protože takové vložení na interní umístění v TMP mohou snížit celkovou flexibilitu a vzhledem k přítomnosti snadno crystallizable rozpustné domény může poskytnout mezimolekulární kontakty potřebné pro krystalizace (Chun et al., 2012; Engel, Chen, & Privé, 2002).
fúze lysozymu T4 (T4L)na vnitřních místech v TMPs dosud poskytla úspěšný přístup pro stanovení struktur různých členů důležité nadčeledi GPCR (Cherezov et al ., 2007; Chien et al., 2010; Dore a kol., 2014; Fenalti a kol., 2014; Granier a kol., 2012; Haga a kol., 2012; Hanson et al., 2012; Hollenstein a kol., 2013; Jaakola a kol., 2008; Kruse a kol., 2012; Manglik a kol., 2012; Rosenbaum et al., 2007, 2011; Shimamura a kol., 2011; Tan a kol., 2013; Wacker a kol., 2013; Wang a kol., 2013; White a kol., 2012; Wu a kol., 2010, 2012; Sü et al., 2011; Zhang et al., 2012). Podobné vnitřní fúze tepelně stabilizovaného apocytochromu b (Wacker et al ., 2013; Wang a kol., 2013; Zhang, Zhang, Gao, Paoletta et al., 2014; Zhang, Zhang, Gao, Zhang, et al., 2014) a rubredoxin (Tan et al., 2013) také přinesly GPCR struktury. Kromě toho, několik GPCR struktur byly získány krystalizací konstruktů, v němž stabilizující protein partner byl fúzován na N-konci receptoru sekvence, spíše než na vnitřní pozici (Fenalti et al., 2014; Rasmussen, Choi, et al., 2011; Rasmussen, DeVree a kol., 2011; Siu et al., 2013; Thompson a kol., 2012; Wu a kol., 2014), což naznačuje, že úloha fúzních proteinů při usnadnění tvorby intermolekulárních kontaktů může být důležitější pro podporu krystalizace než snížení flexibility TMP. Alternativní přístupy pro získání GPCR struktur, které nezahrnují použití fúzních proteinů, zahrnovaly kokrystalizaci anti-receptorovými protilátkami (Kruse et al., 2013; Rasmussen, Choi, et al., 2011; Rasmussen et al., 2007; Rasmussen, DeVree a kol., 2011; Ring et al., 2013) a krystalizace variant GPCR, které byly termostabilizovány zavedením bodových mutací a delecí (Egloff et al., 2014; Scott, Kummer, Tremmel, & Pluckthun, 2013; Tate, 2012). Ve skutečnosti, většina fúzní protein obsahující GPCR varianty použité pro úspěšné stanovení struktury byly také začleněny bodové mutace a truncations určen k dalšímu zvýšení stability proteinu a snížení pružnosti.
Vložení stabilní rozpustné proteiny do TMPs za účelem podpory krystalizace se obecně provádí jako vložení nebo výměna za zbytky ve třetí intracelulární (IC3) smyčky GPCRs. To je založeno na očekávání, že tato oblast v receptorech je flexibilní a může řídit relativní pohyb okolních šroubovice (Rosenbaum et al., 2007), stejně jako snížení pravděpodobnosti, že vložení fúzního partnera naruší celkovou strukturu GPCR (Chun et al ., 2012). Zatímco takové vkládání často nemají narušit celkové struktury receptorů (založené na uchování alespoň některých ligand vazebnou afinitu fúzními konstrukty), dělají to obvykle za následek ztrátu schopnosti aktivovat příbuzný trimerního G proteinu (Rosenbaum et al., 2007), což není překvapivé, protože IC3 smyčka je často místo funkční interakce mezi GPCRs a trimerní G proteiny, které jsou jejich bezprostředním následným efektory. Kromě toho kritéria pro stanovení konkrétních míst spojení pro vložení fúzních proteinů a pro stanovení množství receptorové sekvence, kterou nahrazují, nejsou dobře stanovena. Úspěšné fúzi musí poskytnout optimální zápas mezi rozteč a orientaci N – a C-koncích vloženého proteinu a spojovací místa v GPCR (Chun et al., 2012; Engel a kol., 2002). Vytvoření užitečné fúze tedy může vyžadovat syntézu nebo konstrukci více verzí fúzovaných genů (Rosenbaum et al., 2007).
zde popisujeme strategii pro generování a třídění knihovny variantní formy receptoru obsahující vložení T4L na různých místech ve třetí intracelulární (IC3) smyčky jako náhrada za různá čísla aminokyselinových zbytků ve smyčce (Mathew, Ding, Naider, & Dumont, 2013). Podle vyjádření receptorů u kvasinek, je možné vytvořit randomizované knihovny varianty s lysozym vložení a přímo na displej pro konstrukce s maximální celkový výraz úrovních, čísla ligand vazebná místa na povrchu buněk, a dokonce i funkce receptoru, analyzují na základě aktivace příbuzný G bílkovin. Přístupy byly úspěšné při identifikaci receptorů s vložením do smyčky IC3, které si zachovávají téměř plnou signalizační funkci. To naznačuje, že při připojení pomocí vhodných spojovacích sekvencí může být molekula T4L vložena do této smyčky, aniž by se zabránilo přístupu g proteinu k relevantním povrchům aktivovaného receptoru.
popsané protokoly byly vyvinuty pomocí Ste2p, endogenní GPCR kvasinek Saccharomyces cerevisiae použít jako učenlivý počáteční systém, pro které není trojrozměrná struktura je zatím k dispozici. Podobné přístupy by však mohly být použity k identifikaci variant četných savčích GPCR obsahujících vložení, o nichž bylo hlášeno, že jsou schopné aktivovat cestu odpovědi na feromon kvasinek (Brown et al., 2000; Dowell & Brown, 2009; Král, Dohlman, Thorner, Caron, & Lefkowitz, 1990; Pausch, 1997), nebo na jiné TMPs, pro které je možné test pro funkce v neporušené buňky. Kromě toho byly druhy kvasinek použity jako expresní systémy pro stanovení struktury GPCRs a dalších tmp (Clark et al., 2010), včetně stanovení krystalové struktury lidského histaminového receptoru H1 (Shimamura et al., 2011; Shiroishi a kol., 2011). Ste2p je receptor pro kvasinkové Páření feromonového α-faktoru, peptidu se 13 zbytky. Vazba tohoto ligandu výsledky v aktivaci cytoplazmatické heterotrimeric G bílkovin, který, podle pořadí, aktivuje MAP kinázovou dráhu, což nakonec vede k transkripční reakce, změny ve tvaru buněk, buněčného cyklu zatčení a fusion s kvasinkových buněk opačného páření typu.