Zhoršení substrátu toxicity pomocí IPTG v Escherichia coli BL21(DE3) nesoucí syntetické metabolické dráhy

Biotransformace TCP odpočinku E. coli BL21(DE3) buňky nesoucí varianty syntetické odbourávání

Variant syntetické dráhy představovat buď wild-type haloalkane dehalogenase nebo 26-krát katalyticky efektivnější mutant DhaA31 byly zavedeny do E. coli BL21(DE3) . Tento host byl vybrán, protože ani enzymy ani metabolitů TCP cesta se přirozeně vyskytují v jeho metabolické sítě, a to z důvodu širokého repertoáru komerčně dostupné Duet vektory pro tento kmen, které umožňují laditelné ko-expresi mnoha genů v jedné buňce . To mělo za následek výstavbu flexibilní systém s omezeným rizikem metabolických cross-talk, ve kterém výraz tři dráhy komponenty by mohly být manipulovat ortogonálně . Tři dříve postavené e. byly testovány degradery coli BL21(DE3) označené degWT, deg31 a deg31opt (Tabulka 1). E. coli degWT nese varianta TCP dráhy na základě typu wild-type DhaA spolu s HheC a EchA, vyjádřené v relativní poměr 0.24:0.36:0.40, respektive, jak je stanoveno po pre-indukční s 0,2 mM IPTG (Další soubor 1: Obr. S1). Kmeny deg31 a deg31opt oba nesou TCP cesta představovat inženýrství dehalogenase DhaA31, ale relativní poměr tří enzymů v deg31 je 0.14:0.41:0.45 zatímco v deg31opt je 0.63:0.16:0.21. Dodecyl sulfát sodný polyakrylamidové gelové elektroforézy (SDS-PAGE) experimenty ukázaly, že tři dráhy enzymy dohromady tvořily podobný podíl z celkové rozpustné proteinové frakce produkován všechny tři rozpad: 52 % pro degWT, 54 % pro deg31, a 44 % pro deg31opt.

Pre-indukované (0.2 mM IPTG) klidové buňky každého z rekombinantní kmeny a host control (Tabulka 1) byly inkubovány ve fosfátovém pufru s 2 mM TCP, a čas-kurzy TCP biotransformaci více než 5 h interval byly zaznamenány (Obr. 1). Reakce profily odhalily zásadní rozdíly mezi kmeny s ohledem na počáteční sazby TCP dehalogenation, hromadění meziproduktů, a celkovou účinnost glycerol formace. Teoretické koncentrace glycerolu, jinak rychle využívané e. coli, lze vypočítat z experimentálních koncentrací TCP a detekovaných meziproduktů na základě ortogonální povahy dráhy . Zatímco deg31opt těžil z nejrychlejšího prvního kroku (obr. 1d), nejlepší vyváženou cestou s nejvyšší produkcí glycerolu byla deg31 (obr. 1c). Na druhé straně degWT trpěl pomalou konverzí TCP (obr. 1b), dlouhodobé vystavení toxickému substrátu a nedostatečnému výstupu dráhy. Jak se očekávalo, hostitelská kontrola (nesoucí odpovídající prázdné plazmidy, obr. 1a) nevykazoval žádnou aktivitu vůči TCP v uzavřeném dávkovém systému.

tři E. coli rekombinací a řídicí napětí chybí syntézy představují vhodný modelový systém pro studium příspěvku metabolické zátěže a podkladu/metabolit toxicita pro fitness cena TCP biotransformace po celobuněčné katalyzátory.

Posouzení metabolické zátěže a podkladu toxicita účinky pokovování

životaschopnost Buněk, odhaduje pokovování, je klíčový fyziologický parametr, který by měl odrážet jednotlivé kmeny‘ schopnost vyrovnat se se stresem způsobené metabolickou zátěž a TCP expozice . Degradátory E. coli předem indukované 0.2 mM IPTG a hostitelské kontroly byly pokoveny před a po 5 h inkubace ve fosfátovém pufru s nebo bez 2 mM TCP. Procento přežívajících buněk bylo vypočteno po inkubaci.

údaje získané z pokovování před inkubací (obr. 2a) ilustrují oddělené účinky jednotlivých prvků celkové metabolické zátěže uložené na buňky. Několik faktorů, včetně přítomnosti plasmidu DNA a související výběr značek, přidání IPTG, a zátěž vzhledem k heterologní cestou výraz ovlivnily rozpad životaschopnost souběžně ještě předtím, než toho toxického substrátu. Nejvýraznější vliv v této fázi bylo způsobeno plasmidu údržba a související konstitutivní exprese výběr marker geny z Duet vektory, stejně jako přítomnosti IPTG. Přítomnost dvou plazmidů střední až vysoké kopie pCDF (20-40 kopií na buňku) a pETDuet (~40 kopií na buňku) snížila životaschopnost o 50 % (P < 0,01; obr. 2a). „Preindukce“ hostitelské kontroly s prázdnými plazmidy snížila životaschopnost téměř o 40% ve srovnání s neindukovanou kontrolou (P < 0,01). Exprese enzymů dráhy v degradátorech E. coli dále snížila životaschopnost přibližně o 20 % (P < 0,05). Další snížení životaschopnosti deg31opt ve srovnání s degWT a deg31 může být potenciálně přisoudit rozdílu v antibiotické výběr značek mezi tři rekombinací.

údaje shromážděné po 5 h inkubace s nebo bez protokolu TCP (Obr. 2b a další soubor 1: obr. S2) zahrnovalo několik neočekávaných pozorování. Překvapivě měl TCP (původně přidaný v koncentraci 2 mM) pouze malé nebo zanedbatelné účinky na životaschopnost neindukovaných kontrolních buněk nesoucích prázdné plazmidy; nebyl žádný významný rozdíl v životaschopnosti mezi těmito buňkami a hostitelskými kontrolami, které nebyly vystaveny ani TCP ani IPTG. To bylo nečekané, protože TCP bylo hlášeno, že silně inhibují rostoucí buňky E. coli BL21(DE3) a přírodních hostitelů, jako jsou A. radiobacter AD1 nebo Pseudomonas putida MC4 i v koncentracích 50 % nižší než ty, které zde používá . Na druhé straně byl škodlivý účinek IPTG statisticky významný (P < 0,01) (obr. 2b a další soubor 1: obr. S2). Nejvýraznějším rysem pozorování bylo, že relativní životaschopnosti buněk pre-indukovaná pomocí IPTG, a pak vystaveny TCP bylo téměř 90 % nižší než u hostitele ovládací prvky vystaveny ani látky (P < 0.01) (Obr. 2b). Tato dramatická ztráta životaschopnosti neodpovídá jednoduchému součtu individuálních účinků obou sloučenin; je zřejmé, že IPTG zhoršila toxicitu TCP. Skutečnost, že IPTG zhoršit toxicitu TCP a ne naopak bylo potvrzeno, oplechování tří rekombinací ložiska na syntetické dráhy biodegradace (Obr. 2b). Protože tyto degradátory měly funkční cesty pro degradaci TCP, byly lépe schopny tolerovat její přítomnost. Důležité je, že čím rychlejší je konverze TCP enzymy dráhy, tím větší je životaschopnost degradátorů. Deg31opt, který dosáhl rychlé počáteční konverze TCP, ale nashromáždil významná množství meziproduktů DCP a GDL, přežil inkubaci 5 h téměř stejně jako hostitelskou kontrolu, která nebyla vystavena substrátu. Tato data jsou v souladu s dříve hlášenými výsledky testů zastavení růstu, které ukázaly, že TCP je nejtoxičtější sloučeninou v cestě .

Posouzení metabolické zátěže a podkladu toxicita účinky multi-parametr průtoková cytometrie

Multi-parametr průtoková cytometrie umožňuje současné stanovení několika biochemických a fyzikálních veličin ihned po přípravě vzorků, a proto by měly poskytnout přesnější informace o buněk, fyziologický stav, než mohou být získány tím, pokovování . Tato technika také nabízí klíčové informace o heterogenitě bakteriálních populací. Na rozdíl od pokovování nepodceňuje počet životaschopných buněk v původních kulturách v případech, kdy zlomek populace zažil subletální poškození a ztratil schopnost růstu .

inkubace tří degradátorů a hostitelské kontroly byla provedena za podmínek uvedených v předchozí části. Vzorky odebráno po 5 h inkubace s nebo bez TCP byly barveny propidium jodid (PI), 6-karboxy-2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetát (karboxy-H2DCFDA), nebo bis-(1,3-dibutylbarbituric kyselina) trimethine oxonol . Barviva pro značení nukleových kyselin, jako jsou PI, který teprve vstupuje do buněk s poškozenými membránami, jsou běžně používány s membránový potenciál-citlivých barviv jako DiBAC4(3), který se váže na lipid obsahující intracelulární komponenty, studovat bakteriální životaschopnost . Karboxy-H2DCFDA je chemicky snížena, acetylovaný a karboxylovaný formě fluorescein, který si našel mnoho aplikací, jako obecný ukazatel přítomnosti reaktivních forem kyslíku (ROS) v eukaryotické a prokaryotické buňky . Nedávné studie na bakteriální využití chlorovaných alifatických uhlovodíků naznačují, že tento proces je spojen se silnou oxidační stres a domnívali jsme se, že TCP by také evokovat takové fyziologické reakce . Nasycení nenasycených mastných kyselin tím, že halogenation nebo peroxidace lipidů způsobuje změny v membránové fluidity, což má za následek kolaps elektronového transportního řetězce a předčasné přenos elektronů na kyslík, doprovázené tvorbu ROS, membrane permeabilization, a buněčné smrti .

protokol průtokové cytometrie přijatý v naší studii byl méně citlivý než pokovování při prokázání zátěže způsobené plazmidy (obr. 2b), případně protože přítomnosti heterologní DNA a konstitutivní exprese výběru značky ne přímo změnit vlastnosti, na něž cytometrie ale místo toho nevyvážená buňky celkový energetický stav. Přístup průtokové cytometrie s využitím vybraných fluorochromů byl však užitečný při odhalení toxických účinků IPTG a TCP. Nebyly zjištěny žádné významné rozdíly (P > 0.05) mezi non-indukované hostitele ovládací prvky s prázdnou plasmidy, bez ohledu na jejich TCP expozice stav, s ohledem na všechny tři proměnné zkoumané v těchto experimentech (permeability membrán, tvorbu ROS, a membránový potenciál; viz Obr. 2b). Podíl buněk pozitivních na barvení pro DiBAC4 (3)se však v kontrole léčené samotným IPTG zvýšil až na trojnásobek (P < 0,01). Stejný účinek byl také pozorován u deg31, jehož odpověď na indukci a inkubaci s TCP byla studována podrobněji (obr. 3). Část bakteriální populace barvení pozitivně u všech tří barviv zvýšil mnoho-krát, když pre-léčba pomocí IPTG byla v kombinaci s TCP expozice, což potvrzuje již dříve pozorované prohlubuje účinek a naznačuje, že akce TCP v bakteriální buňky je doprovázen rozsáhlou tvorbu ROS (Obr. 2b, 3). Depolarizace, ROS, akumulace, a permeability membrány byly sníženy v E. coli rekombinací vyjádření syntetické dráhy biodegradace, s mírou snížení je úměrné kmeny‘ počáteční sazby TCP konverze. Zajímavé je, že zhoršení sloučeniny toxicita pre-indukce BL21(DE3) host control s IPTG byla potvrzena také v experimentech s použitím modelu toxické sloučeniny terc-butyl hydroperoxide (TBHP), organických peroxidů a silnou tvorbu ROS podporovat oxidační činidlo (Další soubor 1: Obr. Galaxie). To naznačuje, že popsaný exacerbační jev by neměl být omezen pouze na náš model toxic chemical TCP.

Membránové depolarizace a tvorbu ROS in vivo jsou dynamické procesy. Pro sledování jejich kinetiky u degradátorů E. coli jsme také provedli časově rozlišená měření (další soubor 1: obr. S4). Počet buněk značené DiBAC4(3) a karboxy-H2DCFDA lineárně zvyšují v průběhu času ve všech zdůraznil rekombinací s výjimkou deg31. Zajímavé je, že tento degrader vystavoval počáteční výbuch DiBAC4(3) a karboxy-H2DCFDA fluorescence ale tyto signály pak plateau nebo mírně klesl. Předpokládáme, že charakteristické profily DiBAC4(3) a karboxy-H2DCFDA fluorescence pro deg31 jsou spojeny s jeho unikátní varianta syntetické dráhy biodegradace a odpovídající čas-průběh TCP biotransformace. Na rozdíl od ostatních kmenů byly TCP, 2,3-dichlorpropan-1-ol (DCP) a glycidol (GDL) přítomny v relativně vysokých koncentracích v reakční směsi deg31 mezi minutami 50 a 100 doby měření. To mohlo způsobit synergickou toxicitu, zvýšení počtu buněk s depolarizovanými membránami a zvýšenou tvorbu ROS. Takové společné účinky jsou běžné; byly pozorovány mimo jiné u organofosfátových pesticidů, fluorosurfaktantů a těžkých kovů . Další zmrazení nebo mírný pokles intenzity signálů byla připsána na paralelní odstranění TCP a GDL a výroba glycerolu, který je známý jako účinný stres protectant v droždí a rozpouštědla-tolerantní kmeny E. coli .

varianta syntetické dráhy přítomen v deg31 zdálo se, že poskytují nejlepší kompromis z hlediska zvládání toxicity, zatímco efektivně přeměnit TCP do neškodný glycerol, a proto byl vybrán pro další šetření.

Posouzení metabolické zátěže a podkladu účinky toxicity pomocí elektronové mikroskopie

Metabolickou zátěž a toxicity může způsobit změny v morfologii bakteriálních hostitelů . Proto jsme použili transmisní elektronovou mikroskopii ke studiu změn morfologie indukovaných a neindukovaných buněk deg31 po 5 h inkubaci s nebo bez 2 mM TCP (obr. 3). Obrázky indukovaných a neindukovaných hostitelských kontrolních buněk E. coli s prázdnými plazmidy jsou uvedeny v (další soubor 1: obr. S5). Mikroskopické pozorování bylo doplněno multi-parametr průtoková cytometrie deg31 buňky obarví PI, karboxy-H2DCFDA, nebo DiBAC4(3).

Inkubační non-indukovaný rozpad s TCP vyrábí pouze malá část mrtvých bakteriálních buněk a morfologie buněk léčených tímto způsobem se obecně liší od buněk neexponované toxickým substrátem (Obr. 3a, b). Podíl buněk obarvených karboxy-H2DCFDA a PI se mírně zvýšil, ale nebyl pozorován žádný vliv na membránový potenciál. Pre-vyvolané bakterií produkující rekombinantní proteiny intenzivně tvořil viditelné začlenění těla a ukázal časté oddělování cytoplazmatické membrány od vnější membráně na pólech buňky (Obr. 3c). Vzhledem k tomu, že většina rekombinantních proteinů získaných z buněčných lyzátů byla rozpustná (údaje nejsou uvedeny), věříme, že pozorovaná těla sestávala z aktivních enzymů.

kombinace pre-indukční a inkubace s TCP vyrábí nejvýraznější morfologické změny a byl doprovázen výrazný nárůst v počtu buněk barvení pozitivně pro PI, karboxy-H2DCFDA, a DiBAC4(3) (Obr. 3d). Četné mrtvé nebo umírající buňky s poškozenými cytoplazmatickými membránami a uniklým obsahem byly jasně viditelné. Přesto významná část populace odolávala kombinovaným účinkům IPTG a TCP po dobu 5 hodin léčby. To bylo způsobeno především vyváženou syntetickou cestou deg31 a jeho rychlou konverzí TCP na glycerol. Bistabilita je běžným jevem a lze ji připsat hluku při expresi multigenních znaků odpovědných za toleranci toxicity a odstupňovanou stresovou reakci v bakteriální populaci . Stručně řečeno, naše mikroskopické pozorování deg31 populace léčit pod čtyři různé podmínky byly v souladu s předchozími výsledky a podpořil závěr, že pre-indukce pomocí IPTG zhoršuje TCP toxicity.

Toxicita zhoršení účinek stoupá v buňkách dochází metabolickou zátěž z plazmidů

Vzhledem k tomu, že oba E. coli rozpad a hostitelské ovládací prvky použité v této práci museli vyrovnat s metabolickou zátěž Duet plasmidy a LacIQ/P lacUV5 -T7 expresního systému, jsme se rozhodli zahrnout E. coli kontroly, aniž by tyto komponenty v následující experiment. Pro tento účel jsme použili E. coli BL21(DE3) bez plasmidy a klonovací kmen E. coli DH5a, které postrádá jak LacIQ/P lacUV5 -T7 expresního systému a lac operon. Použitím výše popsaných protokolů pokovování a průtokové cytometrie jsme zjistili, že exacerbační účinek byl u obou kmenů mírný nebo zcela chyběl (další soubor 1: obr. S6A, B). To naznačuje, že dvojitý stres z IPTG a TCP se projevuje pouze u kmenů nesoucích duetové plazmidy a odpovídající expresní systém.

Budeme předpokládat, že studoval rekombinací nemohl efektivně potlačit double stres z IPTG a toxického substrátu vzhledem k metabolické zátěže, která plasmidy a odpovídající nedostatek zdrojů potřebných pro mobilní údržbu. Zdá se, že chemická struktura IPTG, jeho dopravu nebo přítomnost uvnitř buňky aktivuje fyziologické změny, které usnadňují projev TCP toxicity na E. coli BL21(DE3) buněk s Duet plazmidů.

Snížení metabolické zátěže a zhoršení toxicity podle optimalizace koncentrace IPTG

Next, jsme se pokusili snížit zátěž na E. coli rekombinací pomocí optimalizace koncentrace IPTG. Hledali jsme nejnižší možnou koncentraci induktoru, která by minimalizovala náklady na fitness, aniž by byla významně ohrožena účinnost systému při degradaci TCP. Buňky Deg31 byly předem indukovány koncentracemi IPTG v rozmezí od 0, 01 do 1, 00 mM a výsledné účinky na životaschopnost buněk a účinnost dráhy byly studovány (obr. 4; Další soubor 1: obr. S7).

e. coli BL21(DE3) s prázdnou pETDuet a pCDF plazmidů byl použit jako kontrola pro pokovování posoudit zátěž na hostitele pomocí IPTG expozice v nepřítomnosti heterologní cestou (Obr. 4). Životaschopnost pre-indukované degrader a kontroly byla kontrolována před a po 5 h inkubaci ve fosfátovém pufru s 2 mM TCP a porovnání s buňkami, které nejsou vystaveny IPTG (Obr. 4a, b). Procento přežívajících buněk po inkubaci bylo vypočteno v každém případě (obr. 4c). Tyto experimenty ukázaly, že i při absenci TCP existovala inverzní korelace mezi koncentrací IPTG a životaschopností rekombinantní E .coli(obr. 4a). Kmen deg31 trpěl více zvyšujícími se koncentracemi IPTG než kontrolou, pravděpodobně kvůli další zátěži exprimujících genů kódujících syntetickou cestu. Opak byl pravdou po 5 hodinách inkubace, protože kmen TCP-katabolizující deg31 byl odolnější vůči exacerbované toxicitě než kontrola hostitele (obr. 4b, c). Syntetický kmen dráhy vykazoval podobnou míru přežití ve všech testovaných koncentracích IPTG s výjimkou nejvyšší-relativní životaschopnost deg31 předem indukované 1 mM IPTG byla 100 %. Předpokládali jsme, že toto odlehlé hodnoty byl důsledkem podcenění počtu životaschopných buněk před inkubací v důsledku intenzivního stresu zažívají degrader na indukci s tak vysokou koncentrací IPTG a výsledný přítomnost životaschopných-ale-ne-kultivovat buňky v suspenzi . Pokovování experimenty prokázaly, že se část bakteriální populace získala svou schopnost růst a rozmnožovat se nějaký čas po ošetření s vysokou koncentrací IPTG (Další soubor 1: Obr. S8).

čas-kurzy TCP biotransformace s klidové buňky deg31 pre-indukovaná pomocí IPTG na 1.00, 0.20, 0.05, 0.025, 0.01 mM (Další soubor 1: Obr. S7) a denzitometrická analýza SDS polyakrylamidových gelů s odpovídajícími vzorky bezbuněčných extraktů (další soubor 1: obr. S9, tabulka S1) ukázala, že: (i) relativní poměr cestu enzymů a tvar rozkladu profil nijak výrazně měnit s induktorem koncentrace, zatímco (ii) obsah tři dráhy enzymů v celkových rozpustných proteinů z rekombinantních bakterií se snížil z 55 % (1 mM IPTG) na 32 % (0,01 mM IPTG) a cesta je produkce klesla ze 70 na 46 %. Znatelné konverze TCP bylo také dosaženo s neindukovanými buňkami kvůli netěsnosti promotoru T7 a bazální expresi genů v cestě (další soubor 1: obr. S7).

Obrázek 5 shrnuje bilanci tři parametry diskutovány v předcházející části: (i) hostitele životaschopnost, (ii) mobilní výraz cestou enzymů, a (iii) výstup syntetický biologický rozklad trasy. Došli jsme k závěru, že minimální koncentrace IPTG, který umožňuje dostatečné expresi genů v cestě k dosažení přiměřené výstup je 0,025 mM. Podobné koncentrace induktoru, které umožňují plné genové exprese byly zaznamenány pro jednotlivé rekombinantní proteiny jako β-galaktosidázy, zelený fluorescenční protein, a rhamnulose-1-fosfát aldolázy . Všimněte si, že IPTG o koncentraci 0,025 mM je osmkrát nižší než původně testována koncentrace induktoru a až 40-krát nižší než hodnoty uvedené v odborné literatuře popisující inženýrství heterogenní spoje v E. coli . Indukce s nižším množstvím IPTG zlepšila kondici hostitele. Nicméně i nejnižší koncentrace 0,01 mM snižuje životaschopnost bakterií E. coli degrader o 30 % ve srovnání s non-indukované deg31, a až o 50 % ve srovnání s non-indukované host control (P < 0.05 v obou případech; Obr. 4b). Proto jsme zkoumali prostor pro nahrazení IPTG alternativním induktorem.

Snížení metabolické zátěže a zhoršení toxicity tím, že přiměje se laktóza

Laktóza je přírodní induktor lac operon a mohou být použity jako levnější alternativa k syntetické IPTG. Bylo prokázáno, že indukuje expresi rekombinantních proteinů v E. coli ve stejném rozsahu jako IPTG v laboratorních i průmyslových měřítcích . V kontrastu k IPTG, laktóza je substrát pro β-galaktosidázu (kódovaný genem lacZ), a tak může být metabolizován buňky s intaktní lac operon, včetně E. coli BL21(DE3). Proto se koncentrace laktózy do 30 mM běžně používají k indukci exprese klonovaných genů v hladinách, kterých lze dosáhnout při ≤1 mM IPTG .

zkoumali jsme předindukci buněk deg31 s 1 mM laktózou. Předpokládali jsme, že tato koncentrace bude dostatečná k indukci exprese genů TCP degradační dráhy na úrovních, které by poskytly adekvátní účinnost degradace. Toto očekávání bylo potvrzeno nahraný čas-kurzy TCP biotransformace a zjištění, že cesta enzymy tvořily až 41 % buněk celkových rozpustných bílkovin za těchto podmínek (Další soubor 1: Fíky. S7 a S9 a tabulka S1). Teoretická konverze TCP na glycerol za těchto podmínek byla 63 %. Tyto hodnoty jsou blízké hodnotám pozorovaným u buněk deg31 předem indukovaných 0,025 nebo 0,05 mM IPTG. A co je nejdůležitější, deg31 buněk pre-vyvolána laktózy vykazovaly vyšší životaschopnost před a po 5 hod inkubace s TCP v porovnání s bakterií zacházet s IPTG na žádné ze zkoušených koncentrací (P < 0.05; Obr. 4). Stejný uvolňující účinek byl pozorován u kontroly hostitele. Pokud jde o přežití, buňky předem indukované laktózou fungovaly téměř stejně dobře jako jejich neindukované protějšky (obr. 4c). V souladu s pokovování výsledky, průtokovou cytometrii analýza host control a deg31 buněk pre-vyvolané s laktózu odhalila významně nižší hladiny zdůraznil buňky depolarizované membrány, než byla pozorována u E. coli kmenů, pre-indukovaná pomocí IPTG (P < 0.01; Doplňující soubor 1: Obr. S10). Tyto výsledky opět ukázaly, že účinek IPTG ve studovaných rekombinantech byl důsledně doprovázen změnami membránových vlastností.

byla dříve hlášena vyšší životaschopnost buněk indukovaných laktózou místo IPTG pro expresi jednotlivých heterologních proteinů . Tento účinek byl přičítán zpožděné, mírnější indukci dosažené přirozeným induktorem. Na rozdíl od syntetických IPTG, který může vstoupit do buňky rychle obou pasivní difúzí a s pomocí LacY laktózy permeáza, laktóza může jen vstoupit do cytoplazmy přes permeáza. Kromě toho musí být laktóza přeměněna na allolaktózu β-galaktosidázou před vazbou na lac represor, zatímco IPTG se váže přímo na represor. Naše výsledky potvrzují, že laktóza ukládá nižší metabolickou zátěž než IPTG, což naznačuje, že je také vhodnější induktor pro vyjádření celé heterogenní spoje v E. coli BL21(DE3). To je zvláště důležité pro buňky E. coli BL21(DE3) nesoucí syntetické dráhy, které degradují toxické sloučeniny nebo produkují toxické meziprodukty.