Embryo Project Encyclopedia

Guthrie-testi, jota kutsutaan myös PKU-testiksi, on diagnostinen työkalu, jolla pikkulapset testataan fenyyliketonurian varalta muutama päivä syntymän jälkeen. Hoitaakseen Guthrie-testin lääkärit käyttävät Guthrie-kortteja kerätäkseen kapillaariverta lapsen kantapäästä, ja kortit tallennetaan myöhempää testausta varten. RobertGuthrie keksi testin vuonna 1962 Buffalossa, New Yorkissa. Fenyyliketonuria(PKU) on synnynnäinen syntymäpoikkeavuus, jossa toksiset tasot teaminohapon fenyylialaniinin kerääntyä vereen, prosessi, joka vaikuttaaaivoja hoitamattomilla lapsilla. Guthrien testi havaitsee vastasyntyneiden veressä fenyylialaniinia, mikä mahdollistaa PKU: n varhaisen diagnoosin. PKU: n varhaisdiagnosoinnit estävät kehitysvammaisten kehittymisen vuosittain sairastuneiden ihmisten keskuudessa.

PKU on periytyvä metabolinen sairaus, jossa elimistö ei tuota entsymefenyylialaniinihydroksylaasia. Fenyylialaniinihydroksylaasi pilkkoo veressä olevaa fenyylialaniinihappoa. Henkilöt, joilla on PKU, eivät voi pitää fenyylialaniini-aminohappoa korkeina pitoisuuksina. Fenyylialaniinia on runsaasti proteiinipitoisissa elintarvikkeissa, kuten lihassa ja kalassa, sekä makeutusaine aspartaamissa. Kun PKU: ta sairastavat yksilöt eivät sulata fenyylialaniinia syömissään elintarvikkeissa, fenyylialaniinia kertyy vereen runsaasti, mikä aiheuttaa aivovaurioita. Siksi PKU: ta sairastavien henkilöiden on syötävä runsaastirajoitettu ruokavalio välttääkseen sellaisten elintarvikkeiden nauttimisen, joissa on suuria fenyylialaniinipitoisuuksia. Hoitamaton PKU voi johtaa kehitysvammaisuuteen, aivovaurioon ja kohtauksiin. PKU vaikuttaa noin joka 15 000 ihmiseen Yhdysvalloissa vuosittain.

ennen Guthrien testin luomista lääkäri testasi pikkulapsia PKU: n varalta vähemmän luotettavalla ferrikloridivirtsakokeella.Virtsakokeessa ferrikloridilla todettiin fenolien,myös fenyylipyruvaatin, esiintyminen virtsassa. Fenolifenyylipyruvaatin esiintyminen virtsassa osoitti, ettei fenyylialaniini ole liuennut, koska fenyylipyruvaatti on fenyylialaniinin johdannainen.Ferrikloridin virtsakokeen suorittamiseksi lääkäri liuotti virtsanäytteen veteen, etanoliin ja muutamaan pisaraan ferrikloridia. Jos näytteessä oli fenyylipyruvaattia, se muodosti kompleksin ferrikloridin kanssa ja tuotti voimakkaan sinivihreän värin, mikä viittaa siihen, että potilaalla oli PKU. Lääkärit havaitsivat useita ongelmia ferrikloridin virtsakokeessa, mukaan lukien se, että se epäonnistui positiivisen testituloksen tuottamisessa fenyylialaniinipitoisuuksilla, jotka ovat alle 20 millogrammia 100 millilitraa kohti. Tällaisen testin herkkyys oli rajallinen, ja PKU: ta sairastavilla henkilöillä fenyylialaniinipitoisuudet saattoivat helposti jäädä pienemmiksi. Tämän seurauksena lääkärit kamppailevatdiagnosoida ja hoitaa niitä henkilöitä, joilla on PKU, jonka virtsanäytteissä oli alhainen fenyylialaniinipitoisuus, mikä johtaa peruuttamattomiin aivovaurioihin. Monet ferrikloridivirtsatestillä testatut pikkulapset epäonnistuivat PKU: n positiivisessa testissä ensimmäisten kuuden-kahdeksan viikon aikana syntymästä.Todisteet kuitenkin viittasivat siihen, että fenyylialaniinipitoisuudet veressä suurenivat nopeasti ensimmäisten elinpäivien aikana, mikä mahdollisesti johti toneurologisiin vaurioihin tuona aikana. Ferrikloridivirtsatestin epätarkkuuden vuoksi monet PKU: ta sairastavat pikkulapset jäivät diagnosoimatta ja saivat oireita, jotka jatkuivat koko heidän elämänsä ajan.

vuonna 1957 newyorkilaisen Inbuffalon lasten kuntoutuskeskuksen lääkäri Robert Warner pyysi Guthrieta kehittämään luotettavamman ja nopeamman menetelmän PKU: n havaitsemiseksi kuin tuolloin käytettävissä ollut menetelmä. Warner tiesi Guthrien PKU-tutkimuksesta heidän yhteisellä yhteistyöllään Buffalon kehitysvammaisten lasten yhdistyksen kanssa. Hän pyysi Guthrieta luomaan kätevämmän tavan testata PKU: ta, koska tuolloin positiivisen ferrikloriditestin vahvistamiseksi lääkärit lähettivät 50-20 kuutiosenttimetriä laskimoverta testiin Kaliforniassa kunkin potilaan testaamiseksi. Laboratorion teknikot testingsite sitten suoritetaan verikoe vahvistaa tai diskonvahvistaa presenceof korkea fenyylialaniini veressä. Guthrie kehitti newtestin Warnerille muutama päivä alkuperäisen pyynnön jälkeen. Gutriekehitetyssä testissä käytettiin fenyylialaniinin osoittamiseen bakteerien inhibitiomääritystä.

bakteerien inhibitiotestit ovat testejä, joissa tutkijat mittaavat bakteriatolla aineen pitoisuutta näytteessä.β-2-Tienyylialaniini, aminohappo, estää bakteriabacillus subtilis-bakteerin kasvua. Guthrie havaitsi, että fenyylialaniini, PKU: ta sairastavien ihmisten verestä löytynyt kemikaali, kumosi β-2-Tienyylialaniinin B. subtilis-kasvun eston. Siten PKU-inhibitiomäärityksen suorittamiseksi Guthrie päällystettiin geelillä, jota käytetään bakteerien kasvattamiseen withß-2-Tienyylialaniinilla. Sitten Guthrie asetti verinäytteet, jotka oli kuivattu paksulle suodatinpaperille, geelin päälle. Jos verinäytteessä oli fenyylialaniinia, B. subtilis kasvoi verinäytteen ympärillä ja osoitti, että potilaalla oli PKU. Jos verinäytteessä ei ollut fenyylialaniinia, B. subtilis ei kasvanut verinäytteen ympärille,mikä osoittaa, ettei potilaalla ollut PKU: ta. Guthrie totesi, että asingle technician pystyi testaamaan yhdestä 200 verinäytettä yhden päivän aikana ja että jokainen testi vaati vain sormenpiikin kapillaariverta suodatinpaperilevyllä.

kehitettyään testin ja näytettyään sen Warnerille Guthrie testasi bakteerien inhibitiotestinsä herkkyyden käyttäen fenyylialaniinilla terästettyjä normaaleja verinäytteitä. Herkkyys on testattavuus havaita kaikki tapaukset, joissa tauti on läsnä.Guthrie lisäsi normaaleihin verinäytteisiin 2, 4, 8, 12 ja 20 milligrammaa l-fenyylialaniinia 100milligrammin veriseerumia kohti, jotta ne jäljittelisivät fenyylialaniinin pitoisuuksia potilailla, joilla on PKU. Hän inkuboi kuivuneita verinäytteitä, joihin oli lisätty l-fenyylialaniinia yön yli bakteerien estotesteissä, ja havaitsi, että bakteereita oli kasvanut paperilevyjen ympärille. Hän määritti, että näytteissä oli bakteerikasvustoa, joka sisälsi 12 ja 20 milligrammaa fenyylialaniinia 100 milligrammaa seerumia kohti, mikä tarkoittaa, että näytteet osoittivat henkilön mahdollisesti hadPKU: ta ja että hänelle olisi tehtävä lisää verikokeita.

arvioituaan testinsä laboratoriossa Guthrie vertasi testinsä ja ferrikloridivirtsatestin tuloksia 3 118 näytteeseen Newarkin osavaltion innewarkissa New Yorkissa. Tämän jälkeen Guthrie vahvisti kaikki Guthrie-testissä määritetyt positiiviset tapaukset ja ferrikloridivirtsatesti kvantitatiivisella verimäärityksellä. Hän vertasi Guthrien testin tuloksia ferrikloridivirtsatestin tuloksiin ja niiden herkkyyteen havaita tauti tarkasti. Guthrie havaitsi, että hänen testissään havaittiin kaksikymmentä onepositiivista PKU-tapausta, jotka vahvistettiin myös kvantitatiivisessa verimäärityksessä, ja ferrikloridivirtsakokeessa havaittiin vain seitsemäntoista näistä tapauksista, eli ferrikloridivirtsakokeessa ei huomattu neljää PKU-tapausta. Guthrien mukaan nämä tiedot viittasivat siihen, että hänen testiään voitaisiin käyttää uusien PKU-tapausten havaitsemiseen populaatioissa, jotka on jo seulottu ferrikloridivirtsatestillä.

Guthrie uudisti menetelmäänsä tekemällä verenkeruusta helpompaa lääkäreille. Jos lääkärit diagnosoivat potilaat aikaisemmin, potilaat saattoivat toteuttaa proteiinirajoitetun ruokavalion ennen kuin fenyylialaniini-aminohappo kohosi veren totoksipitoisuuksia ja aiheutti peruuttamattomia neurologisia vaurioita.Testinsä ensimmäisen menestyksen jälkeen Guthrie muutti bacterialinhibition-määritystään niin, että imeväiset voitiin testata muutaman päivän kuluttua birth.To Guthrie selvitti, toimisiko pieni kokoelma vauvan kantapään verta bakterialinhibition-määrityksessä. Hän teki kortteja, joita myöhemmin kutsuttiin Guthrie-korteiksi, jotka olivat pieniä suodatinpapereita, joissa jokaisessa oli metallinen terä,joka puhkaisi lapsen Sheelin ja keräsi syntyneen veren. Hän antoi veren kuivua suoraan kortille ja säästi sen testausta varten. Kortista, hän sitten reikä rei ’ itetty noin paperi levy verta sijoitetaan myöhemmin agar gelculture. Guthrie havaitsi, että bakteerien estotesti tehosi infantin kantavereen.

Guthrien kehitettyä PKU-testinsä New Yorkin NewYorkissa toimiva kehitysvammaisten kansalaisten kansallinen yhdistys alkoi tukea Guthrien testin käyttöä ja valitsi kaksi sisarta, joilla oli PKU: n mallilapsinaan vuoden 1961 kokeessa, jonka tarkoituksena oli julkaista testi. Isosisko, Sheila McGrath, oli mentaldisabilities ja oli diagnosoitu PKU myöhemmin elämässä. Nuorukainen Kammy McGrath sai Guthrien testissä PKU-diagnoosin ja hänet hoidettiin jo varhain, jolloin hän välttyi kehitysvammaisuudelta. Vuonna 1961 kehitysvammaisten kansallinen yhdistys julkisti Guthrien testin lehdistötilaisuudessaan San Franciscossa, Kaliforniassa, ja Life-lehti julkaisi artikkelin guthriesta ja hänen vastasyntyneestä näytöstään seuraavana vuonna.

myös vuonna 1961 Yhdysvaltain Lasten toimisto inWashington, D. C. rahoitti Guthrien testaamista 400 000 pikkulapsella. Guthrie ja hänen tiiminsä testasivat 404 568 pikkulasta PKU: n varalta Guthrie-testillä ja ferrikloridivirtsatestillä. Guthrie tiimeineen diagnosoi 37 PKU-tapausta kahdessa vuodessa. Guthrien testeissä 275 pienokaista todettiin PKU-positiivisiksi, eli heillä oli todennäköisesti PKU. Niistä 275 pikkulapsesta,joiden oletettiin olevan PKU-positiivisia, 377 PKU-tapausta vahvistettiin toistamalla Guthrien testi ja käyttämällä kvantitatiivista verimääritystä, mikä tarkoittaa, että testi oli tehokas.

vuonna 1962 Guthrie solmi sopimuksen Indianan Elkhartissa sijaitsevan Ames Companyn kanssa Miles Laboratories-yhtiön valmistuksesta ja markkinoinnista sairaaloille. Ames-yhtiö kuitenkin määräsi, että he tekisivät sopimuksen vain, jos testi saisi patentin. Guthrie haki apatentiksi Guthrien testiä omissa nimissään vuonna 1962. Tämän jälkeen hän solmi yksinoikeudellisen lisenssisopimuksen Ames Companyn kanssa. Lisenssisopimus antoi Guthrielle ei rojalteja, mikä tarkoittaa, että Guthrie ei tekisi yhtään rahaa myydyistä testipakkauksista. Viisi prosenttia testin nettotuloista jaettiin National Association for Retarded CitizensResearch Fund-järjestön, New Yorkcityn Raajarikkojen lasten Auttamisyhdistyksen ja Buffalon yliopiston säätiön kesken Buffalossa NewYorkissa. Guthrie ei määrännyt, mihin hintaan sarjat tulisi myydä sopimuksessa.

sopimuksen allekirjoittamisen jälkeen Ames Companyn oli vaikea valmistaa tarpeeksi testipakkauksia kysynnän tyydyttämiseksi. Guthrie auttoi testien tuottamisessa ja sai taloudellista tukea Yhdysvaltain Lastenvirastolta (US Children ’ s Bureau) tehdäkseen 500 testiä vuokratussa talossa Buffalossa, New Yorkissa. Guthrien sarjat myytiin 6 dollarilla kappale. Vuonna 1963 Guthri sai tietää, että Ames Company suunnitteli veloittavansa 262 dollaria jokaisesta samasta PKUtest-pakkauksesta. Elämäkerran kirjoittajan Jean Kochin mukaan Guthrie vaati hinnan alentamista. Guthrie kysyi Russell B. Long,Yhdysvaltain senaattori Louisianasta, tutkii tapausta selvittääkseen, oliko Ames-yhtiöllä täysi laillinen määräysvalta testipakkausten hintaan.

senaattori Long kertoi, että Yhdysvaltain terveysministeriön alainen Washington DC: n osasto Theus Public Health Service ei ollut hyväksynyt Guthrien sopimusta yksityisen Ames-yhtiön kanssa. Kaksi vapaaehtoista terveydenhoitoyhdistystä ja Buffalon Lastensairaala olivat kuitenkin tukeneet sopimusta, joten Ames-yhtiöllä oli täysi määräysvalta hintaan. Tutkija Diane B. Paul, Guthrie pahoitteli syvästi sitä, ettei sopimukseen sisällytetty hintamääräystä. Tämän jälkeen Ames-yhtiö julkaisi ilmoituksen, jonka mukaan yhtään pakettia ei myyty 262 dollarilla ja että tuhansia dollareita käytettiin Guthrie-testipakkausten rakennusten valmistuskulujen kattamiseen. Yhtiö myi testipakkauksia, joita pystyi testaamaan 325 pikkulapselle 67,71 dollarilla kappale.

löydettyään yrityksen, joka valmisti hänen testejään, Guthrie kamppaili saadakseen sairaalat toteuttamaan testin ja lääketieteelliset julkaisut julkaisemaan hänen koetuloksensa. Guthrie ja PKU: n lasten vanhemmat painostivat lainsäätäjiä valtuuttamaan PKU: n uudet lapset jokaisessa osavaltiossa. Vuonna 1963 Massachusetts valtuutti newbornscreeningin PKU: lle. Samana vuonna Guthrie julkaisi osan tuloksistaan vertaisarvioidussa lehdessä. Tämän jälkeen Guthrie kampanjoi monissa valtioissa ja maissa pitäen puheita ja luentoja konferensseissa kannustaakseen hallituksia valtuuttamaan Guthrie-testin. Vuoteen 1966 mennessä Guthrien testi oli pakollinen useimmissa Yhdysvaltain osavaltioissa.

1960-luvun jälkeen tutkijat kiinnittivät enemmän huomiota PKU: hun. Vuonna 1990 tutkijat ympäri maailmaa kokoontuivat keskustelemaan PKU: n diagnoosin ja hoidon edistymisestä Parisissa, Ranskassa. Myöhemmin samana vuonna Yoshiyukiokanon johtama ryhmä tutkijoita Teksasin Houstonissa teki fenyylialaniinihydroksylaasin tuotannosta vastaavan PAH-geenin mutaatioanalyysin. Kyseinen tutkijaryhmä loi myös tietokannan Pahgeenin mutaatioille. PAH-tietokannan avulla dokumentoitiin yli 340 geenimutaatiota, jotka voivat aiheuttaa PKU: ta. Myös 1990-luvulla yhdysvaltalaiset tutkijat Donald Chase, David Millington, Naoto Terada, Stephen Kahler, CharlesRoe ja Lindsay Hofman kehittivät uuden tekniikan PKU usingtandemin massaspektrometrian testaamiseksi. Tutkijat käyttävät tandem-massaspektrometria toseparaatti-ioneja, jotka perustuvat niiden varaus-massa-suhteeseen PKU: n havaitsemiseen verinäytteissä. Tandem-massaspektrometria, kuten alkuperäinen Guthrie-testi, käyttääreikä-punch kuivattua verta. Se voi kuitenkin seuloa laajemman lajinsyntyisten sairauksien yhden näytteen avulla.

2000-luvulle tultaessa kaikki viisikymmentä Yhdysvaltain osavaltiota vaativat sairaaloita testaamaan vastasyntyneitä PKU: n varalta,ja Guthrie-testiä käytettiin monissa paikoissa ympäri maailmaa. Taloudellisesti kehittymättömien alueiden lääkärit käyttivät Guthrie-testiä diagnosoidakseen PKU: n aiheuttamia infektioita. Kuitenkin 2000-luvulla monet sairaalatkäyttivät tandem-massaspektrometriaa, joka voi seuloa laajempaa valikoimaa kongenitaalisia sairauksia kuin Guthrie-testi. Molemmat menetelmät käyttävät yhä Guthrie-kortteja imeväisten kuivuneen veren tallentamiseen testausta varten.