Geelisuodatuskromatografiaa

Geelisuodatuskromatografiaa

Geelisuodatuskromatografiaa, joka on kokoluokituksen mukainen poissulkukromatografia, voidaan käyttää joko näytteen molekyylien ja kompleksien fraktiointiin tietyn kokoluokan fraktioiksi, jolloin kaikki tiettyä kokoa suuremmat molekyylit poistetaan näytteestä, tai molempien toimintojen yhdistelmään. Geelisuodatuskromatografialla voidaan erottaa vesiliuoksessa olevia yhdisteitä, kuten pieniä molekyylejä, proteiineja, proteiinikomplekseja, polysakkarideja ja nukleiinihappoja. Kun liikkuvana faasina käytetään orgaanista liuotinta, prosessia kutsutaan geelipermeaatiokromatografiaksi.

Geelisuodatuskromatografiaa voidaan käyttää myös:

• molekyylien ja kompleksien fraktiointi ennalta määrätyssä kokoluokassa
• kokoanalyysi ja määritys
• suurten proteiinien ja kompleksien poistaminen
• Puskurinvaihto
• suolan poisto
• pienten molekyylien, kuten nukleotidien, alukkeiden, väriaineiden ja vierasaineiden poistaminen
• näytteen puhtauden arviointi
• sitoutuneiden radioisotooppien erottaminen sitoutumattomista radioisotoopeista

geelisuodatuskromatografialiuokset kaikkiin edellä mainittuihin käyttötarkoituksiin on saatavilla valmiiksi pakatuissa painovoimavirtakolonneissa, Spin-kolonneissa, matalapaineisissa ja keskipainekromatografiakolonnit ja pullotetut hartsit.

Geelisuodatuskromatografiamekanismi

geelisuodatuskromatografiakolonnissa stationäärifaasi koostuu huokoisesta matriisista ja liikkuva faasi on puskuri, joka virtaa matriisihelmien välissä. Helmillä on määritelty huokoskokoalue, jota kutsutaan fraktiointialueeksi. Molekyylit ja kompleksit, jotka ovat liian suuria tunkeutumaan huokosiin, pysyvät liikkuvassa faasissa ja liikkuvat puskurin virtauksen mukana kolonnin läpi. Pienemmät molekyylit ja kompleksit, jotka pystyvät liikkumaan huokosiin, tulevat stationäärifaasiin ja liikkuvat geelisuodatuspylvään läpi pidempää reittiä helmien huokosten läpi.

jokainen molekyyli tai kompleksi, joka ylittää tietyn geelisuodatuskromatografiakolonnin fraktiointialueen, liikkuu kolonnin läpi nopeammin kuin mikään stationäärifaasiin pääsevä molekyyli. Siksi jokainen näytteen aineosa, joka on fraktiointialueen yläpuolella, eluoituu ensin (tyhjässä tilavuudessa) ennen mitään, joka on fraktiointialueella. Vähimmäiskoko, joka jää liikkuvaan vaiheeseen eikä siirry stationaariseen vaiheeseen, tunnetaan poissulkurajana. Bio-Rad tarjoaa geelisuodatuskromatografialevyjä ja kolonneja, joiden poissulkurajat vaihtelevat yli kolmen suuruusluokan välillä 100 daltonista 100 000 daltoniin (100 kDa).

Stationäärifaasiin pääsevät molekyylit ja kompleksit fraktioidaan niiden koon mukaan. Pienemmät molekyylit siirtyvät syvälle huokosiin ja hidastuvat enemmän kuin suuremmat molekyylit, jotka eivät pääse niin helposti huokosiin, ja siten eluoituvat kolonnista nopeammin. Tämä ero huokossiirtymissä johtaa komponenttien fraktiointiin koon mukaan siten, että suurin eluointi tapahtuu ensin.

geelisuodatuskromatografiakolonneissa, jotka on suunniteltu suolanpoistoon, puskurinvaihtoon ja pienten molekyylien kuten nukleotidien poistoon, suolat ja pienet yhdisteet pääsevät helposti huokosiin, hidastuvat ja kulkeutuvat kolonnin läpi hitaammin kuin suuremmat proteiinit tai nukleiinihapot. Tämän vuoksi näytteessä olevat ainesosat eluoidaan ennen suoloja, nukleotideja jne. Tätä mekanismia käyttävät DNA-puhdistussarjat sisältävät usein geelisuodatuksen spin-sarakkeita.

erottelukyky, joka tässä määritellään kokoluokkien välisten rajojen terävyydeksi, määräytyy helmen koon ja useiden muiden tekijöiden perusteella. Pienempi helmikoko antaa yleensä suuremman erotuskyvyn geelisuodatuskromatografiakolonnissa. Kompaktit molekyylit diffuusioituvat stationäärifaasin läpi nopeammin kuin lineaariset molekyylit. Koon poissulkemiseen, fraktiointialueeseen ja eluutionopeuteen vaikuttavat puskurikoostumus, ionivahvuus ja pH. monimutkaisten proteiiniseosten fraktioinnissa eluutioajat ja koon poissulkemisen rajat on ehkä määritettävä empiirisesti.

Geelisuodatuskromatografialiuokset

tärkeä kriteeri geelisuodatuskromatografialiuoksille on, että elatusaine on inertti ja että mikään näytteessä tai puskurissa ei sitoudu elatusaineeseen. Toinen seikka on käytettävän geelisuodatuskolonnin tyyppi ja se, käytetäänkö sitä paineistetussa kromatografiajärjestelmässä vai painovoimavirta-tai spin-kolonneissa. Jos käytetään paineistettua kromatografiajärjestelmää, sekä kolonnin että väliaineen on kestettävä käytetty paine ja virtausnopeus.

geelisuodatuskromatografiassa yleisesti käytetyt väliaineet perustuvat agaroosi-tai polyakryyliamidihelmiin, dekstroosi painovoima-tai matalapainejärjestelmiin ja polymeerihartsit keskipainejärjestelmiin. Väliaineen valinta riippuu erotettavien komponenttien ominaisuuksista ja muista kokeellisista tekijöistä. Seuraavat ovat yleisiä huomioita määritettäessä geelisuodatuskromatografialevyjen valintaa:

• Jakotislausalue
• Kokopoikkeusraja
• käyttöpaine
• virtausnopeus
• näytteen viskositeetti
• pH-alue
• Autoklavoituvuus
• Vedensekaantuvuuden toleranssi orgaaniset liuottimet; jotkin näytteet saattavat liuketa paremmin vesi-orgaaninen seos
• toleranssi pesuaineille, kaotrooppisille aineille, formamidille jne.
• Käyttölämpötila

näytteiden tyypit, väliaineen valinta ja kromatografiajärjestelmän asetukset määrittävät, mitkä parametrit ovat tärkeimmät tietyssä puhdistussovelluksessa.