IPTG: n aiheuttama substraattimyrkytyksen paheneminen Escherichia coli BL21(DE3)-bakteereissa, joissa on synteettinen metaboliareitti

TCP: n biotransformaatio lepäävissä E. coli BL21(DE3) – soluissa, joissa on synteettisen hajoamisreitin variantteja

synteettisen reitin variantteja, joissa esiintyy joko villityyppiä Haloalkaanidehalogenaasi eli 26-kertainen katalyyttisesti tehokkaampi mutantti dhaa31 kulkeutui E. coli Bl21: een(de3) . Tämä isäntä valittiin, koska TCP-reitin entsyymit tai metaboliitit eivät esiinny luonnostaan sen metaboliaverkossa ja koska tälle kannalle on tarjolla laaja valikoima kaupallisesti saatavilla olevia Duettovektoreita, jotka mahdollistavat useiden geenien viritettävän yhteisekspression yhdessä solussa . Tämä johti siihen, että rakennettiin joustava systeemi, jossa metabolisen ristipuheen riski oli vähäinen ja jossa kolmen reitin komponenttien ilmentymistä voitiin manipuloida ortogonaalisesti . Kolme aiemmin rakennettua E: tä. coli BL21(DE3) – degwt -, deg31-ja deg31opt-hajoamisaineet testattiin (Taulukko 1). E. coli degWT kantaa TCP-reitin muunnosta, joka perustuu villin tyypin DhaA: han yhdessä HheC:n ja EchA:n kanssa, ilmaistuna suhteellisena suhteena 0,24: 0,36: 0,40, kuten määritetään esiinduktiolla 0,2 mM: n IPTG: llä (Lisätiedosto 1: Fig. S1). Deg31-ja deg31opt-kannat kantavat TCP-reittiä, jossa on dehalogenaasi DhaA31, mutta deg31:n kolmen entsyymin suhteellinen suhde on 0,14:0,41:0,45, kun taas deg31optissa se on 0,63:0,16: 0,21. Natriumdodekyylisulfaattipolyakryyliamidigeelielektroforeesi (SDS-PAGE) – kokeet osoittivat, että kolmen reitin entsyymien osuus kaikkien kolmen hajoamisaineen tuottamasta liukoisesta proteiinifraktiosta oli yhtä suuri: 52% degWT: lle, 54% deg31: lle ja 44% deg31opt: lle.

esivaali (0.2 mM IPTG) jokaisen rekombinanttikannan lepäävät solut ja isäntäkontrolli (Taulukko 1) inkuboitiin fosfaattipuskurissa 2 mM TCP: llä, ja TCP: n biotransformaation aikajaksot 5 tunnin välein kirjattiin (Kuva. 1). Reaktioprofiilit paljastivat kantojen välillä perustavanlaatuisia eroja suhteessa TCP-dehalogenaation alkunopeuksiin, välituotteiden kertymiseen ja glyserolin muodostumisen kokonaistehokkuuteen. Glyserolin teoreettiset pitoisuudet, joita E muuten nopeasti hyödyntää. coli, voitaisiin laskea kokeellisista pitoisuuksista TCP ja havaittu välituotteiden nojalla reitin ortogonaalinen luonne . Vaikka deg31opt hyötyi nopeimmasta ensimmäisestä vaiheesta (Kuva. 1d), paras tasapainoinen reitti, jolla oli suurin glyserolin tuotanto, oli deg31 (Kuva. 1c). Toisaalta degWT kärsi hitaasta TCP-muuntamisesta (Fig. 1b), pitkäaikainen altistuminen myrkylliselle substraatille ja riittämätön reitin ulostulo. Odotetusti isäntäohjaus (kuljettavat vastaavat tyhjät plasmidit, Kuva. 1a) ei osoittanut aktiivisuutta kohti TCP suljetussa eräjärjestelmässä.

kolme E: tä. coli-rekombinantit ja kontrollikanta, jolta puuttuu synteettinen reitti, ovat sopiva mallijärjestelmä tutkittaessa metabolisen taakan ja substraatti-/metaboliittitoksisuuden osuutta kokosolukatalyyttien TCP-biotransformaation soveltuvuuskustannuksiin.

metabolisen taakan ja substraatin toksisuusvaikutusten arviointi pinnoituksella

solujen elinkyky, jota arvioidaan pinnoituksella, on keskeinen fysiologinen parametri, jonka pitäisi kuvastaa yksittäisten kantojen kykyä selviytyä metabolisen taakan ja TCP-altistuksen aiheuttamasta rasituksesta . E. coli hajoaa ennalta indusoituna 0: lla.2 mM IPTG ja isäntäohjaimet pinnoitettiin ennen ja jälkeen 5 tunnin inkubaation fosfaattipuskurissa 2 mM TCP: n kanssa tai ilman. Eloonjääneiden solujen prosenttiosuus laskettiin inkubaation jälkeen.

pinnoituksesta ennen inkubaatiota saadut tiedot (Kuva. 2A) kuvaavat solujen metabolisen kokonaisrasituksen yksittäisten elementtien erillisiä vaikutuksia. Useat tekijät, kuten plasmidi-DNA: n ja siihen liittyvien valintamarkkereiden esiintyminen, IPTG: n lisääminen ja heterologisesta reitti-ilmentymisestä johtuva rasitus, vaikuttivat hajoavien aineiden elinkelpoisuuteen rinnakkain jo ennen myrkyllisen substraatin lisäämistä. Voimakkain vaikutus tässä vaiheessa johtui plasmidin ylläpidosta ja siihen liittyvästä duettovektorien valintamarkkerigeenien konstitutiivisesta ilmentymisestä sekä IPTG: n esiintymisestä. Kahden keskitason tai korkean kopioplasmidin pCDF (20-40 kopiota solua kohti) ja pETDuet (~40 kopiota solua kohti) läsnäolo vähensi elinkykyä 50 % (P < 0, 01; Kuva. 2 a). Isäntäkontrollin ”esiinduktio” tyhjillä plasmideilla vähensi elinkykyä lähes 40% verrattuna indusoimattomaan kontrolliin (P < 0, 01). Reittientsyymien ilmentyminen E. coli-hajoamistuotteissa vähensi elinkelpoisuutta edelleen noin 20 % (p < 0, 05). Deg31opt: n elinkyvyn aleneminen degWT: hen ja deg31: een verrattuna voi mahdollisesti johtua kolmen rekombinanttitekijän eroista antibioottien valintamarkkereissa.

5 tunnin inkubaation jälkeen kerätyt tiedot TCP: llä tai ilman (Kuva. 2b ja Lisätiedosto 1: kuva. S2) sisälsi useita yllättäviä havaintoja. Yllättävää kyllä, TCP: llä (joka alun perin lisättiin 2 mM: n konsentraatiolla) oli vain vähäisiä tai vähäisiä vaikutuksia tyhjillä plasmideilla varustettujen indusoimattomien kontrollisolujen elinkelpoisuuteen.; näiden solujen ja isäntäkontrollien, jotka eivät altistuneet TCP: lle eivätkä IPTG: lle, elinkelpoisuudessa ei ollut merkittävää eroa. Tämä oli odottamatonta, koska TCP: n on raportoitu estävän voimakkaasti E. coli BL21: n(DE3) ja luonnollisten isäntien, kuten A. radiobacter AD1: n tai Pseudomonas putida MC4: n kasvavia soluja jopa 50% pienemmillä pitoisuuksilla kuin tässä käytetyt . Toisaalta IPTG: n haitallinen vaikutus oli tilastollisesti merkitsevä (P < 0, 01) (viikuna. 2b ja Lisätiedosto 1: kuva. S2). Hätkähdyttävin havainto oli, että ennen IPTG: llä indusoitujen ja sitten TCP: lle altistuneiden solujen suhteellinen elinkelpoisuus oli lähes 90% pienempi kuin isäntäkontrollien, jotka altistuivat kummallekaan aineelle (P < 0, 01) (Kuva. 2b). Tämä dramaattinen elinkelpoisuuden menetys ei vastaa näiden kahden yhdisteen yksittäisten vaikutusten yksinkertaista summaa; on selvää, että IPTG pahensi TCP: n myrkyllisyyttä. Se, että IPTG pahensi TCP: n myrkyllisyyttä eikä päinvastoin, vahvistettiin kolmen rekombinantin pinnoituksella, joilla on synteettinen biohajoamisreitti (Fig. 2b). Koska näillä rappeuttajilla oli toimivat kulkureitit TCP: n hajoamiseen, ne pystyivät sietämään paremmin sen läsnäoloa. Tärkeää on, että mitä nopeammin TCP: n muuntaminen polkuentsyymeillä, sitä suurempi on hajoavien elinkelpoisuus. Deg31opt, joka saavutti TCP: n nopean alkumuunnoksen, mutta keräsi merkittäviä määriä välituotteita DCP: tä ja GDL: ää, selvisi 5 tunnin inkubaatiosta lähes yhtä hyvin kuin isäntäkontrolli, joka ei altistunut substraatille. Nämä tiedot ovat yhdenmukaisia aiemmin raportoitujen kasvupysähdystestien tulosten kanssa, joiden mukaan TCP on reitin myrkyllisin yhdiste .

metabolisen taakan ja substraattimyrkyllisyyden vaikutusten arviointi moniparametrisella virtaussytometrialla

Moniparametrisella virtaussytometrialla mahdollistaa useiden biokemiallisten ja fysikaalisten muuttujien samanaikaisen määrittämisen heti näytteen valmistamisen jälkeen, minkä vuoksi solujen fysiologisesta tilasta pitäisi saada tarkempaa tietoa kuin pinnoituksella saadaan . Tämä tekniikka tarjoaa myös keskeistä tietoa bakteeripopulaatioiden heterogeenisuudesta. Toisin kuin pinnoitus, se ei aliarvioi elinkelpoisten solujen määrää alkuperäisviljelmissä tapauksissa, joissa murto-osa väestöstä on kokenut subletaalisia vammoja ja menettänyt kasvukyvyn .

kolmen hajoamislaitteen ja isäntäkontrollin inkubointi suoritettiin edellisessä jaksossa mainituin edellytyksin. TCP: llä tai ilman 5 tunnin inkubaation jälkeen otetut näytteet värjättiin propidiumjodidilla (pi), 6-karboksi-2′,7′-diklooridihydrofluoreseiinidiasetaatilla (karboksi-H2DCFDA) tai bis-(1,3-dibutyylibarbituurihapolla) trimetiinioksonolilla . Nukleiinihappojen merkitsemiseen tarkoitettuja väriaineita, kuten PI: tä, joka menee vain soluihin, joiden kalvot ovat heikentyneet, käytetään yleisesti kalvopotentiaalille herkkien väriaineiden kanssa, kuten dibac4(3), joka sitoo lipidipitoisia solunsisäisiä komponentteja, bakteerien elinkelpoisuuden tutkimiseen . Karboksi-H2DCFDA on kemiallisesti pelkistetty, asetyloitu ja karboksyloitu fluoreseiinin muoto, joka on löytänyt monia sovelluksia yleisindikaattorina reaktiivisten happilajien (ROS) esiintymiselle eukaryoottisissa ja prokaryoottisissa soluissa . Viimeaikaiset tutkimukset kloorattujen alifaattisten hiilivetyjen bakteerien käytöstä viittaavat siihen, että tämä prosessi liittyy voimakkaaseen oksidatiiviseen stressiin, ja oletimme, että myös TCP herättäisi tällaisen fysiologisen reaktion . Tyydyttymättömien rasvahappojen kyllästyminen halogenoimalla tai lipidiperoksidaatiolla aiheuttaa muutoksia kalvon juoksevuudessa, mikä johtaa elektroninsiirtoketjujen romahtamiseen ja ennenaikaiseen elektroninsiirtoon hapelle, johon liittyy ROS: n muodostuminen, kalvon permeabiloituminen ja solukuolema .

tutkimuksessamme omaksuttu päätepistevirtaussytometriaprotokolla ei ollut yhtä herkkä kuin pinnoitus plasmidien aiheuttaman rasituksen osoittamisessa (Kuva. 2b), mahdollisesti siksi, että heterologisen DNA: n esiintyminen ja valintamarkkereiden konstitutiivinen ilmentyminen eivät suoraan muuttaneet sytometrian kohteena olevia ominaisuuksia, vaan sen sijaan epätasapainottivat solujen kokonaisenergiatilaa. Valittuja fluorokromeja käyttävä virtaussytometrinen lähestymistapa oli kuitenkin hyödyllinen IPTG: n ja TCP: n toksisten vaikutusten paljastamisessa. Merkittäviä eroja ei ollut (P > 0.05) ei-indusoitujen isäntäkontrollien välillä tyhjillä plasmideilla riippumatta niiden TCP-altistustilasta suhteessa mihin tahansa näissä kokeissa tutkituista kolmesta muuttujasta (kalvon läpäisevyys, ROS: n muodostuminen ja kalvon potentiaali; KS.Kuva. 2b). Pelkällä IPTG: llä hoidetussa kontrolliryhmässä dibac4(3) positiivisten solujen osuus nousi kuitenkin jopa kolminkertaiseksi (P < 0, 01). Sama vaikutus havaittiin myös deg31: llä, jonka vastetta induktioon ja inkubaatioon TCP: llä tutkittiin tarkemmin (Fig. 3). Bakteeripopulaation osuus värjäytyi positiivisesti kaikilla kolmella värillä moninkertaistui, kun IPTG-esikäsittely yhdistettiin TCP-altistukseen, mikä vahvisti aiemmin havaitun pahentavan vaikutuksen ja osoitti, että TCP: n toimintaan bakteerisoluissa liittyy laaja ROS-muodostuminen (Figs. 2 B, 3). Kalvon depolarisaatio, ROS-kertymä ja kalvon läpäisevyys vähenivät E. coli-rekombinaateissa, jotka ilmentävät synteettistä biohajoamisreittiä, ja vähentymisaste oli verrannollinen kantojen TCP-muuntumisnopeuteen. Mielenkiintoista on, että yhdisteen myrkyllisyyden paheneminen bl21(DE3)-isäntäkontrollin esiinduktiolla IPTG: llä vahvistettiin myös kokeissa, joissa käytettiin myrkyllisen yhdisteen mallia tert-butyylihydroperoksidi (TBHP), orgaaninen peroksidi ja vahva Ros-muodostuminen, joka edistää oksidatiivista ainetta (Lisätiedosto 1: Fig. S3). Tämä viittaa siihen, että kuvattua pahenemisilmiötä ei pitäisi rajoittaa vain malliimme myrkylliseen kemialliseen TCP: hen.

kalvon depolarisaatio ja ROS: n muodostuminen in vivo ovat dynaamisia prosesseja. Niiden kinetiikan seuraamiseksi E. coli-hajoamislaitteissa teimme myös aikaratkaisuja (Lisätiedosto 1: Fig. S4). DiBAC4(3): n ja karboksyylih2dcfda: n värjäämien solujen määrä lisääntyi lineaarisesti ajan myötä kaikissa stressaantuneissa rekombinanteissa deg31: tä lukuun ottamatta. Mielenkiintoista on, että tämä hajotin osoitti aluksi dibac4(3): n ja karboksi-H2DCFDA: n fluoresenssin purkauksen, mutta nämä signaalit sitten tasaantuivat tai laskivat hieman. Oletamme, että dibac4: n(3) ja karboksi-H2DCFDA-fluoresenssin ominaisprofiilit deg31: lle ovat yhteydessä sen ainutlaatuiseen muunnokseen synteettisestä biohajoamisreitistä ja vastaavaan TCP: n biotransformaation aikakauteen. Muista kannoista poiketen TCP, 2,3-diklooripropaani-1-oli (DCP) ja glysidoli (GDL) olivat suhteellisen suurina pitoisuuksina deg31-reaktioseoksessa mittausjakson 50-100 minuutin välillä. Tämä on saattanut aiheuttaa synergististä toksisuutta, mikä on lisännyt depolarisoituneiden kalvojen solujen määrää ja tehostanut ROS: n muodostumista. Tällaiset nivelvaikutukset ovat yleisiä; niitä on havaittu muun muassa organofosfaatin torjunta-aineilla, fluorosurfaktanteilla ja raskasmetalleilla . Signaalien jäätymisen tai keskivaikean vähenemisen katsottiin johtuvan TCP: n ja GDL: n rinnakkaisesta poistumisesta sekä glyserolin tuotannosta, jonka tiedetään olevan tehokas stressinsuoja hiiva-ja liuotinsietokannoissa .

deg31: ssä esiintyvä synteettisen reitin muunnos näytti tarjoavan parhaan kompromissin myrkyllisyydestä selviytymisen kannalta samalla, kun TCP muutetaan tehokkaasti vaarattomaksi glyseroliksi, minkä vuoksi se valittiin jatkotutkimuksiin.

metabolisen taakan ja substraattitoksisuuden vaikutusten arviointi elektronimikroskopialla

metabolinen taakka ja toksisuus voivat aiheuttaa muutoksia bakteerien isäntien morfologiassa . Siksi käytimme transmissioelektronimikroskopiaa tutkiaksemme indusoitujen ja indusoimattomien deg31-solujen morfologian muutoksia 5 tunnin inkubaation jälkeen 2 mM TCP: llä tai ilman (Kuva. 3). Kuvat indusoiduista ja indusoimattomista E. coli-isäntäkontrollisoluista, joissa on tyhjiä plasmideja, on esitetty (Lisätiedosto 1: Fig. S5). Mikroskooppihavaintoja seurasi MONIPARAMETRINEN virtaussytometria DEG31-soluista, jotka oli värjätty piillä, karboksyylih2dcfda: lla tai DiBAC4: llä(3).

indusoimattomien hajoavien solujen inkubaatio TCP: llä tuotti vain pienen osan kuolleista bakteerisoluista, eikä tällä tavoin käsiteltyjen solujen morfologia yleensä Eronnut myrkylliselle substraatille valottamattomien solujen morfologiasta (Kuva. 3 A, b). Karboksyylih2dcfda: n ja PI: n värjäämien solujen osuus lisääntyi kohtalaisesti, mutta vaikutusta kalvopotentiaaliin ei havaittu. Pre-indusoidut bakteerit, jotka tuottavat rekombinanttiproteiineja, muodostivat intensiivisesti näkyviä inkluusiokappaleita ja osoittivat sytoplasmakalvoston usein irtoavan solun uloimmasta kalvosta solun napojen kohdalla (Kuva. 3c). Koska suurin osa solulysaateista saaduista rekombinanttiproteiineista oli liukoisia (tietoja ei ole esitetty), uskomme, että havaitut elimet koostuivat aktiivisista entsyymeistä.

pre-induktion ja inkubaation yhdistelmä TCP: n kanssa aiheutti selvimmät morfologiset muutokset ja siihen liittyi merkittävä lisäys PI: n, karboksyylih2dcfda: n ja DiBAC4: N(3) positiivisten solujen määrässä (Fig). 3d). Selvästi näkyi lukuisia kuolleita tai kuolevia soluja, joiden sytoplasmakalvostot olivat vaurioituneet ja sisältö vuotanut. Silti merkittävä osa väestöstä vastusti IPTG: n ja TCP: n yhteisvaikutuksia 5 tunnin hoitojakson aikana. Tämä johtui pääasiassa deg31: n tasapainoisesta synteettisestä reitistä ja sen nopeasta TCP: n muuntamisesta glyseroliksi. Bistabiliteetti on yleinen ilmiö ,ja sen voidaan katsoa johtuvan myrkyllisyyden sietokyvystä vastaavien monigeenisten piirteiden ja bakteeripopulaation asteittaisen stressivasteen ilmentymisestä. Yhteenvetona voidaan todeta, että mikroskooppiset havaintomme deg31-populaatioista, joita hoidettiin neljässä eri tilanteessa, olivat yhdenmukaisia aiempien tulosten kanssa ja tukivat päätelmää, että esiinduktio IPTG: llä pahentaa TCP-toksisuutta.

toksisuuden pahenemisvaikutukset lisääntyvät soluissa, jotka kärsivät plasmidien metabolisesta rasituksesta

koska sekä E. coli-hajoamistuotteiden että tässä työssä käytettyjen isäntäkontrollien oli selviydyttävä duettoplasmidien ja LacIQ/P lacUV5-T7-ekspressiojärjestelmän metabolisesta rasituksesta, päätimme sisällyttää E. coli-kontrollit ilman näitä komponentteja seuraavaan kokeeseen. Tähän tarkoitukseen käytettiin E. coli BL21(DE3) ilman plasmideja ja Kloonaus kanta E. coli DH5a, josta puuttuu sekä LacIQ/P lacUV5-T7 expression system ja lac operon. Käyttämällä edellä kuvattuja pinnoitus-ja virtaussytometriaprotokollia havaitsimme, että pahenemisvaikutus oli vaatimaton tai täysin poissa molemmissa kannoissa (Lisätiedosto 1: Fig. S6A, B). Tämä viittaa siihen, että IPTG: n ja TCP: n aiheuttama kaksoisstressi ilmenee vain kantoina, jotka kantavat Duettoplasmideja ja vastaavaa ekspressiojärjestelmää.

oletamme, että tutkitut rekombinantit eivät pystyneet tehokkaasti tukahduttamaan IPTG: n ja myrkyllisen substraatin aiheuttamaa kaksoisstressiä plasmidien aiheuttaman metabolisen rasituksen ja vastaavasti solujen ylläpitoon tarvittavien resurssien puutteen vuoksi. Näyttää siltä, että iptg: n kemiallinen rakenne, sen kuljetus tai läsnäolo solun sisällä laukaisee fysiologisia muutoksia, jotka helpottavat TCP-toksisuuden ilmenemistä E. coli BL21(DE3) – soluissa Duettoplasmideilla.

metabolisen taakan ja toksisuuden pahenemisen vähentäminen säätämällä IPTG-pitoisuutta

seuraavaksi yritimme vähentää E. coli-rekombinanttien taakkaa optimoimalla IPTG-pitoisuuden. Etsimme alhaisin mahdollinen pitoisuus indusaattori, joka minimoi kuntokustannukset vaarantamatta merkittävästi järjestelmän tehokkuutta halventava TCP. Deg31-solujen esiinduktiot IPTG-pitoisuuksilla olivat 0, 01-1, 00 mM, ja niiden vaikutuksia solujen elinkykyyn ja reitin tehokkuuteen tutkittiin (Kuva. 4; Lisätiedosto 1: kuva. S7).

E. coli BL21(DE3), jossa on petduet-ja pCDF-plasmidit, käytettiin pinnoituksen kontrollina arvioitaessa IPTG-altistuksen isännälle aiheuttamaa taakkaa heterologisen reitin puuttuessa (Kuva. 4). Pre-indusoidun hajottajan ja kontrollin elinkelpoisuus tarkastettiin ennen 5 tunnin inkubaatiota ja sen jälkeen fosfaattipuskurissa, jossa on 2 mM TCP, ja verrattiin niiden solujen elinkelpoisuuteen, jotka eivät altistu IPTG: lle (Kuva. 4 A, b). Kussakin tapauksessa laskettiin eloonjäävien solujen prosenttiosuus inkubaation jälkeen (kuva. 4c). Nämä kokeet osoittivat, että jopa TCP: n puuttuessa IPTG-pitoisuuden ja rekombinantin E. colin elinkelpoisuuden välillä oli käänteinen korrelaatio (Fig. 4 A). Deg31-kanta kärsi enemmän IPTG-pitoisuuksien kasvusta kuin kontrolli, mikä johtui todennäköisesti synteettistä reittiä koodaavien geenien ilmentymisen aiheuttamasta lisätaakasta. Tilanne oli päinvastainen 5 tunnin inkubaation jälkeen, koska TCP-katabolisoiva deg31-kanta oli vastustuskykyisempi pahenevalle myrkyllisyydelle kuin isäntäkontrolli (Kuva. 4b, c). Synteettisen reitin kannalla elossaololuvut olivat samanlaiset kaikilla testatuilla IPTG-pitoisuuksilla lukuun ottamatta korkeinta—1 mM: n IPTG: llä indusoidun deg31: n suhteellinen elinkyky oli 100 %. Oletimme, että tämä poikkeava arvo johtui elinkelpoisten solujen määrän aliarvioinnista ennen inkubaatiota johtuen voimakkaasta stressistä, jota degeneraattori kokee induktion yhteydessä, kun iptg-pitoisuus on niin suuri, ja siitä, että suspensiossa on elinkelpoisia, mutta ei-viljeltäviä soluja . Pinnoituskokeet osoittivat, että osa bakteeripopulaatiosta sai takaisin kykynsä kasvaa ja lisääntyä jonkin aikaa tämän suuren iptg-pitoisuuden käsittelyn jälkeen (Lisätiedosto 1: Fig. S8).

TCP: n biotransformaation aikarajat lepäävillä deg31-soluilla, jotka on indusoitu IPTG: llä 1, 00, 0, 20, 0, 05, 0, 025 ja 0, 01 mM (Lisätiedosto 1: Fig. S7) ja SDS: n polyakryyliamidigeelien tiheysmittaus vastaavien soluttomien uutteiden näytteiden kanssa (lisätiedosto 1: kuva. S9, taulukko S1) osoitti, että: (i) reittientsyymien suhteellinen suhde ja hajoamisprofiilin muoto eivät merkittävästi muuttuneet indusoijakonsentraation myötä, kun taas (ii) kolmen reitin entsyymien pitoisuus rekombinanttibakteerien liukoisen proteiinin kokonaismäärässä laski 55%: sta (1 mM IPTG) 32%: iin (0, 01 mM IPTG) ja reitin tuotos laski 70%: sta 46%: iin. TCP: n huomattava muuntaminen saavutettiin myös indusoimattomilla soluilla T7-promoottorin vuotavuuden ja geenien perusekspression vuoksi reitin sisällä (Lisätiedosto 1: Fig. S7).

Kuvassa 5 esitetään yhteenveto edellä käsitellyistä kolmesta muuttujasta: i) isännän elinkelpoisuus, ii) reittientsyymien soluekspressio ja iii) synteettisen biohajoamisreitin tuotos. Johtopäätöksemme on, että pienin IPTG-pitoisuus, joka mahdollistaa riittävän geenien ilmentymisen reitin sisällä kohtuullisen tuotoksen saavuttamiseksi, on 0, 025 mM. samanlaisia induktoripitoisuuksia, jotka mahdollistavat täyden geenin ilmentymisen, on raportoitu yksittäisille rekombinanttiproteiineille, kuten β-galaktosidaasille, vihreälle fluoresoivalle proteiinille ja ramnuloosi-1-fosfaattialdolaasille . On huomattava, että 0,025 mM: n IPTG-pitoisuus on kahdeksan kertaa pienempi kuin alun perin testattu induktoripitoisuus ja jopa 40 kertaa pienempi kuin E. colin heterologisten reittien suunnittelua kuvaavassa tieteellisessä kirjallisuudessa ilmoitetut arvot . Induktio pienemmillä IPTG – määrillä paransi isännän kuntoa. Pienikin pitoisuus, 0,01 mM, kuitenkin vähensi E. coli-hajoavan aineen elinkelpoisuutta 30 % indusoimattomaan deg31: een verrattuna ja jopa 50% indusoimattomaan isäntäkontrolliin verrattuna (P < 0,05 molemmissa tapauksissa; Kuva. 4b). Siksi tutkimme mahdollisuuksia korvata IPTG vaihtoehtoisella induktorilla.

metabolisen taakan ja toksisuuden pahenemisen vähentäminen indusoimalla laktoosia

laktoosi on Lac operonin luonnollinen indusoija ja sitä voidaan käyttää synteettisen IPTG: n halvempana vaihtoehtona. Sen on osoitettu indusoivan rekombinanttien proteiinien ilmentymistä E. coli-bakteereissa samassa määrin kuin IPTG: tä sekä laboratorio-että teollisuusasteikoissa . Toisin kuin IPTG, laktoosi on β-galaktosidaasin substraatti (lacZ: n koodaama) ja voi siten metaboloitua soluissa, joissa on ehjä lac operon, mukaan lukien E. coli BL21(DE3). Tämän vuoksi käytetään yleisesti jopa 30 mM: n laktoosipitoisuuksia kloonattujen geenien ilmentymisen indusoimiseksi tasoilla, jotka voidaan saavuttaa ≤1 mM: n IPTG: llä .

tutkimme deg31-solujen esiinduktiota 1 mM laktoosilla. Oletimme, että tämä pitoisuus riittäisi indusoimaan TCP-hajoamisreitin geenien ilmentymisen tasoilla, jotka antaisivat riittävän hajoamistehokkuuden. Tätä odotusta vahvistivat TCP: n biotransformaation kirjatut aikajaksot sekä havainto, että reittientsyymien osuus solujen liukoisen proteiinin kokonaismäärästä oli näissä olosuhteissa jopa 41% (Lisätiedosto 1: Figs. S7 ja S9 sekä taulukko S1). TCP: n teoreettinen muuntuminen glyseroliksi näissä olosuhteissa oli 63 %. Nämä arvot ovat lähellä arvoja, joita on havaittu deg31-soluissa, jotka on indusoitu 0, 025 tai 0, 05 mM: n IPTG: llä. Tärkeintä on, että laktoosilla valmiiksi indusoitujen deg31-solujen elinkyky oli parempi ennen 5 tunnin inkubaatiota ja sen jälkeen TCP: llä verrattuna IPTG: llä hoidettuihin bakteereihin millä tahansa testatulla pitoisuudella (P < 0, 05; Kuva. 4). Sama lievittävä vaikutus havaittiin isäntäkontrollissa. Selviytymisen kannalta laktoosilla ennalta indusoidut solut suoriutuivat lähes yhtä hyvin kuin niiden indusoimattomat vastineet (Kuva. 4c). Pinnoitustulosten mukaisesti virtaussytometrinen analyysi isäntäkontrollista ja laktoosilla ennalta indusoiduista deg31-soluista paljasti depolarisoiduilla kalvoilla rasittuneiden solujen pitoisuuden olevan huomattavasti alhaisempi kuin IPTG: llä indusoiduilla E. coli-kannoilla (P < 0, 01; Lisätiedosto 1: Fig. S10). Nämä tulokset viittasivat jälleen siihen, että IPTG: n vaikutukseen tutkituissa rekombinanteissa liittyi johdonmukaisesti muutoksia kalvon ominaisuuksissa.

aiemmin raportoitiin, että yksittäisten heterologisten proteiinien ilmentymisen yhteydessä solujen elinkyky oli suurempi laktoosilla indusoitujen solujen elinkyky iptg: n sijaan . Tämän vaikutuksen katsottiin johtuvan viivästyneestä, lievemmästä induktiosta, joka saavutetaan luonnollisella induktorilla. Toisin kuin synteettinen IPTG, joka pääsee soluun nopeasti sekä passiivisen diffuusion kautta että pitsimäisen laktoosiperseaasin avulla, laktoosi pääsee sytoplasmaan vain permeaasin kautta. Lisäksi laktoosi on muutettava allolaktoosiksi β-galaktosidaasin avulla ennen kuin se sitoutuu Lac-repressoriin, kun taas IPTG sitoutuu suoraan repressoriin. Tuloksemme vahvistavat, että laktoosi aiheuttaa pienemmän metabolisen taakan kuin IPTG, mikä viittaa siihen, että se on myös sopivampi indusoija kokonaisten heterologisten reittien ilmentymiseen E. coli BL21: ssä(DE3). Tämä on erityisen tärkeää E. coli BL21(DE3) – soluille, jotka kuljettavat synteettisiä reittejä, jotka hajottavat myrkyllisiä yhdisteitä tai tuottavat myrkyllisiä välituotteita.