2-D elektroforeesi alkaa elektroforeesilla ensimmäisessä ulottuvuudessa ja erottaa molekyylit kohtisuorasti ensimmäisestä muodostaen elektroferogrammin toisessa ulottuvuudessa. Elektroforeesissa ensimmäisessä ulottuvuudessa molekyylit erotetaan lineaarisesti isoelektrisen pisteensä mukaan. Toisessa ulottuvuudessa molekyylit erotetaan 90 asteessa ensimmäisestä elektroferogrammista molekyylimassan mukaan. Koska on epätodennäköistä, että kaksi molekyyliä olisivat samanlaisia kahdessa eri ominaisuudessa, molekyylit erotetaan tehokkaammin toisistaan 2-D-elektroforeesissa kuin 1-D-elektroforeesissa.
kaksi dimensiota, jotka proteiinit erotetaan tällä tekniikalla, voivat olla isoelektrinen piste, proteiinikompleksimassa native-tilassa tai proteiinimassa.
proteiinien erottamista isoelektrisen pisteen mukaan kutsutaan isoelektriseksi fokusoinniksi (IEF). Näin geeliin kohdistetaan pH-gradientti ja geeliin kohdistetaan sähköinen potentiaali, jolloin toinen pää on positiivisempi kuin toinen. Kaikilla muilla pH-arvoilla kuin niiden isoelektrisellä pisteellä proteiinit varautuvat. Jos ne ovat positiivisesti varautuneita, ne vedetään kohti geelin negatiivisempaa päätä ja jos ne ovat negatiivisesti varautuneita, ne vedetään geelin positiivisempaan päähän. Ensimmäisessä ulottuvuudessa käytettävät proteiinit liikkuvat geeliä pitkin ja kerääntyvät isoelektriseen pisteeseensä eli pisteeseen, jossa proteiinin kokonaisvaraus on 0 (neutraali varaus).
tutkittaessa proteiinien toimintaa solussa on oleellista tietää niiden yhteistoiminnasta. Useimmiten proteiinit toimivat yhdessä komplekseina ollakseen täysin toimivia. Tämän solun organelleorganisaation analysointi vaatii tekniikoita, joilla säilytetään proteiinikompleksien luontainen tila. Natiivissa polyakryyliamidigeelielektroforeesissa (native PAGE) proteiinit pysyvät natiivitilassaan ja erotetaan sähkökentässä massansa ja kompleksiensa massan mukaan vastaavasti. Erotuksen saamiseksi koon eikä nettovarauksen mukaan, kuten IEF: ssä, lisävaraus siirretään proteiineihin käyttämällä Coomassie Briljanttisinistä tai litiumdodekyylisulfaattia. Ensimmäisen dimension valmistuttua kompleksit tuhotaan soveltamalla denaturoivaa SDS-sivua toiseen ulottuvuuteen, jossa proteiinit, joista kompleksit koostuvat, erotetaan massallaan.
ennen kuin proteiinit erotetaan massasta, ne käsitellään natriumdodekyylisulfaatilla (SDS) yhdessä muiden reagenssien kanssa (SDS-PAGE in 1-D). Tämä denaturoi proteiinit (eli se avaa ne pitkiksi, suoriksi molekyyleiksi) ja sitoo joukon SDS-molekyylejä suunnilleen suhteessa proteiinin pituuteen. Koska proteiinin pituus (avautuessaan) on suurin piirtein verrannollinen sen massaan, tämä vastaa sitä, että siihen kiinnittyy useita SDS-molekyylejä, jotka ovat suunnilleen verrannollisia proteiinin massaan. Koska SDS-molekyylit ovat negatiivisesti varautuneita, tästä seuraa, että kaikkien proteiinien massa-varaus-suhde on suunnilleen sama kuin toistensa. Lisäksi proteiinit eivät siirry, kun niillä ei ole varausta (tulos isoelektrinen tarkennus vaihe) siksi pinnoite proteiinin SDS (negatiivisesti varautunut) mahdollistaa siirtymisen proteiinien toisessa ulottuvuudessa (SDS-sivu, se ei ole yhteensopiva käytettäväksi ensimmäisessä ulottuvuudessa, koska se on ladattu ja nonioninen tai zwitterioninen pesuaine on käytettävä).toisessa ulottuvuudessa, sähköinen potentiaali on jälleen sovellettu, mutta 90 asteen kulmassa ensimmäisestä kentästä. Proteiinit vetävät puoleensa geelin positiivisempaa puolta (koska SDS on negatiivisesti varautunut) suhteessa niiden massa-varaus-suhteeseen. Kuten aiemmin selitettiin, tämä suhde on lähes sama kaikille proteiineille. Proteiinien etenemistä hidastavat kitkavoimat. Geeli siis toimii kuin molekyylitason sieve, kun nykyinen levitetään, erottamalla proteiinit perusteella niiden molekyylipaino suurempi proteiineja säilytetään suurempi geeli ja pienempiä proteiineja, jotka voivat kulkea seulan läpi ja saavuttaa alemmat alueet geeli.