tulokset ja keskustelu
PCR-RFLP-analyysi, paljasti rajoitusmalleja, jotka olivat yhteensopivia silico-analyysin kanssa. Kaikki koirat hännän epämuodostuma esitti saman kuvion (3 fragmentit, 2 näkyvä bändit), joka oli erilainen kuin esitetty koirat normaali häntä (2 fragmentit, 1 näkyvä bändi) (Kuva.1). Toista määritystä, joka perustui myös PCR-RFLP: hen, käytettiin onnistuneesti saman mutaation tunnistamiseen koirien T-geenissä, mutta käyttäen polyakryyliamidigeelielektroforeesijärjestelmää (Gruszczynska & Czapla 2011). Polyakryyliamidigeelielektroforeesin suorituskyky voisi tässä tutkimuksessa parantaa kaistojen erottelukykyä suhteessa DNA-fragmentteihin. Käytännöllisyys kuitenkin vähenisi, sillä tämä järjestelmä on työläämpi. Tässä tutkimuksessa ei ollut mahdollista visualisoida kaikkia digestion jälkeen syntyneitä DNA-fragmentteja, mutta genotyypit voitiin erottaa helposti agaroosigeelielektroforeesilla.
Kuva.1. PCR-RFLP c189g-mutaation toteamiseen. Merkki emäsparien (M), sairastuneet koirat – lyhyt häntä (1-7) ja eläimen normaali häntä (8).
sekvensoitujen näytteiden analyysissä heterotsygoottisuutta C (sytosiini) G (guaniini) havaittiin ekson 1: n nukleotidi 189: ssä vain koirilla, joilla oli hännän epämuodostuma. Mutaation sijainti perustui Genbankissa saatavilla olevaan t-geenin mRNA-sekvenssiin (liittymisnumero: AJ245513).
in silico-analyysissä havaittiin myös aminohappo 63: n muuttuminen isoleusiinista metioniiniksi. Kaikki tässä tutkimuksessa saadut DNA-sekvenssit talletettiin Genbankiin liittymisnumeroilla MF495488 (lyhyt häntä), MF495489 (hännän puuttuminen), MF495490 (hännän puuttuminen) ja mf495491 (normaali häntä).
vaikka vain yksi genotyyppi todettiin nykyisen tilan (CG eläimille, joilla on hännän epämuodostuma), fenotyypin vaihtelua havaittiin sairailla koirilla, mikä on hännän koko. Joillakin eläimillä oli lyhyt häntä (noin 3-4 nikamaa), ja toisilla hännän puuttuminen (noin 1-2 nikamaa) (Kuva.2). Samanlaisia fenotyyppejä havaittiin myös Haworth et al. (2001) koirissa. Vaikka selitys tähän ei ole vielä tiedossa koirilla, Buckingham et al. (2013), tutkii synnynnäistä hännän koon vaihtelua kissoilla, löysi todisteita haploinsufficiency aiheuttama useita mutaatioita T-geenin. C. 1199delc, c.1169delc ja c.998delT-mutaatiot liittyivät eritasoisiin geeniekspressioihin, mikä saattoi selittää erilaiset fenotyypit koirilla, joilla oli hännän epämuodostuma (Buckingham et al. 2013).
Kuva.2. A) koira, joka kantaa c189g-mutaatiota T-geenissä. B) saman pentueen koira ilman C189G-mutaatiota.
mutaation periytyvyys voidaan osoittaa hereditaarianalyysillä (Kuva.3) tutkitusta pentueesta. Oli mahdollista todentaa, että mutaatiolla on autosomaalinen dominoiva periytymiskuvio. Tässä tutkimuksessa ei kuitenkaan löytynyt dominoivaa homotsygoottista (GG) genotyyppiä, mikä vahvistaa havaintoja siitä, että homotsygoosissa mutatoitunut T-geeni aiheuttaa sikiön kuoleman (Haworth et al. 2001). Hytonen ym. (2009) havaittiin, että normaalihäntäisten eläinten (CC-genotyyppi) risteytysten poikueet olivat 29% suurempia kuin epämuodostuneiden häntäeläinten (CG-genotyyppi) risteytysten poikueet. Tämä tulos sopii yhteen sen kanssa, että jälkeläisten määrä vähenee 25 prosenttia tappavien alleelien risteytyksistä.
Kuva.3. Heredogrammi, joka näyttää c189g-mutaation periytymisen labradorinnoutajan T-geenissä. Emon isovanhempien (I), sairastuneen koiran pentueen ja sen risteyttämisen normaalin uroksen (II) ja analysoidun (III) pentueen välillä.
t-geenin mutaatioihin on liittynyt hännän epämuodostumia muilla lajeilla, kuten hiirillä ja kissoilla (Wilson ym. 1995, Buckingham ym. 2013). Ja joissakin niistä havaitaan myös muita muutoksia, kuten kissojen virtsankarkailu ja ulosteenpidätyskyvyttömyys (Robinson 1993). Kuitenkin, koirilla, tähän mennessä, vain hännän epämuodostumia on havaittu heterotsygoottisia eläimiä (CG) (Indrebo et al. 2008). Vaikka joissakin koirarodut ”hännän epämuodostuma” fenotyyppi ei liittynyt c189g mutaatio (Bostoninterrieri, Englanti bulldoggi, King Charles Spaniel, kääpiösnautseri, Parsonrussellinterrieri, ja Rottweiler), suuri määrä rotujen vaikuttaa viittaa antiikin mutaatio (Hytonen et al. 2009), joka oli läsnä esi-isien koirissa ennen monien rotujen muodostumista. Rotujen välinen risteytyminen on kuitenkin saattanut vaikuttaa myös mutaation diffuusioon, sillä CG-heterotsygooteilla eläimillä ei näytä olevan libidoa tai lisääntymiskyvyn muutoksia. Toinen mutaatiodiffuusioon mahdollisesti vaikuttanut tekijä oli käyttö häntättömien koirien lisääntymisessä, jolloin esteettinen caudektomia oli vielä sallittu. Tänä aikana on todennäköisesti käytetty monia eläimiä, joilla on pyrstöageneesi, lisääntäjinä, koska hännän puuttuminen oli suotavaa joillakin roduilla, mikä edesauttoi mutaation diffuusiota.
nykyisin caudektomia (kirurginen hännän poisto) on kielletty toimenpide useissa maailman maissa, kuten Euroopan unionin maissa ja Brasiliassa (Haworth et al. 2001, CFMV 2013). Joissakin Euroopan unionin maissa käytetään geenitestejä, joilla tunnistetaan T-geenin c189g-mutaatio, sen todentamiseksi, onko hännän puuttuminen joillakin roduilla synnynnäistä tai onko eläimille tehty epäsäännöllinen kirurginen toimenpide. Tässä tutkimuksessa käytetty PCR-RFLP oli yksinkertainen ja tarkka menetelmä tämän mutaation tunnistamiseksi, ja sitä voitiin käyttää todisteena laittoman caudektomian tunnistamisessa.
koska tietoa c189g-mutaatiosta koirien T-geenissä on niukasti, sen yhteydestä muihin morfologisiin tai edes fysiologisiin hahmoihin ei ole tarkempaa tietoa, minkä vuoksi sitä on tutkittava.