samanlainen geneettinen koodi on useimmilla eliöillä maapallolla, mutta eri eliöillä on erilaisia mieltymyksiä koodatessaan tiettyjä aminohappoja. Tämä on mahdollista, koska kussakin kodonissa on 4 emästä (A, T, C ja G) ja 3 kantaa. On siis 64 mahdollista kodonia, mutta vain 20 aminohappoa ja 3 pysäyttävää kodonia koodaamaan, jolloin 41 kodonia on kateissa. Tuloksena on redundanssi; useat kodonit koodaavat yksittäisiä aminohappoja. Evolutiiviset rajoitteet ovat muokanneet sitä, mitä kodoneja käytetään ensisijaisesti, joissa eliöillä on kodonin käyttöharhaa.
löydät monia kodonitaulukoita, joista käy ilmi, mitkä kodonit koodaavat mitäkin aminohappoja (katso esimerkki oikealla). Näin yksinkertaisilla säännöillä voisi luulla, että on helppo keksiä toimiva DNA-sekvenssi, joka koodaa kiinnostavan peptidin ja tuottaa sen haluamaasi organismiin. Valitettavasti kodonimieltymykset tekevät siitä niin, että et voi valita mahdollisten kodonien joukosta sattumanvaraisesti ja odottaa sekvenssisi ilmenevän hyvin missä tahansa organismissa.
mitkä ovat siis ne evolutiiviset rajoitteet, jotka johtavat näihin mieltymyksiin, ja mitä voimme tehdä niille? Lue lisää saadaksesi selville!
miksi eliöillä on erilaisia kodonin käyttöbiaaseja?
syitä eliöiden erilaisiin kodonimieltymyksiin ei täysin ymmärretä, mutta joitakin mahdollisia syitä ovat:
- metaboliset paineet – tarvitaan soluresursseja tuottamaan trnoja, jotka tunnistavat eri kodonit, muokkaavat trnoja oikein ja lataavat trnoja sopivilla aminohapoilla. Jos eliö käyttää vain osajoukkoa kodoneja, sen tarvitsee tuottaa vain osajoukon varattuja trnoja, minkä vuoksi se saattaa tarvita vähemmän resursseja koko käännösprosessiin. Esimerkiksi korkean kasvunopeuden olosuhteissa E. coli ensisijaisesti lisää trnas: n tuotantoa, joka tunnistaa kodonit, joita esiintyy voimakkaasti ilmentyvissä geeneissä (Emilsson and Kurland, 1990).
- geeniekspression säätely geenisekvenssin avulla – proteiineja, joita koodaavat kodonit, joilla on vähän tai heikosti varautuneet trnat, voidaan tuottaa hitaammin kuin proteiineja, joita koodaa erittäin runsas, varautunut tRNAs. Esimerkiksi Tuller et al. todettiin, että käännös tehokkuus korreloi hyvin kodonin bias sekä E. coli ja S. cerevisiae.
- proteiinin taitto – jos proteiinia koodaa kodonien seos, jossa on voimakkaasti ja huonosti varautuneita trnoja, proteiinin eri alueet voivat muuntua eri tahtiin. Ribosomi liikkuu nopeasti alueilla, jotka vaativat runsaita, varattuja trnoja, mutta pysähtyy alueilla, jotka vaativat vähäistä runsautta, huonosti varattuja trnoja. Kun ribosomi pysähtyy, se voi antaa nopeasti käännetyille alueille mahdollisuuden taittaa kunnolla. Esimerkiksi Pechmann ja Frydman havaitsivat, että epä-optimaaliset kodonit liittyvät tiettyihin sekundaarirakenteisiin 10: ssä läheisesti toisiinsa liittyvässä hiivakannassa.
- sopeutuminen muuttuviin olosuhteisiin-eliöiden on usein ilmaistava geenejä eri tasoilla eri olosuhteissa. Vaihtelevalla kodonin käytöllä eliö voi muuttaa, mitkä proteiinit ilmentyvät voimakkaasti ja mitkä huonosti tuottamalla ja lataamalla tiettyjä tRNA-pooleja. Esimerkiksi aminohappoa biosynteettisiä entsyymejä koodaavissa geeneissä käytettävät tRNAs-entsyymit saattavat varautua ensisijaisesti aminohappojen nälkiintymisen aikana, mikä johtaa aminohappo biosynteettisten entsyymien suurempaan tuotantoon (Dittmar et al., 2005).
miten kodonin käytön vinous vaikuttaa kokeisiini?
vaikka kodonin mieltymykset voivat olla hyvin hyödyllisiä eliöille, ne voivat olla ongelmallisia tutkijoille, jotka yrittävät ilmaista proteiineja heterologisissa isännissä. Jos vain monistaa kiinnostavan geenin ihmisen perimästä, esimerkiksi se ei välttämättä ilmene lainkaan kolibakteerissa (netistä löytyy erilaisia tietokantoja, joissa esitellään eri eliöiden kodonimieltymyksiä). Vaikka geeni olisi käännetty, se ei välttämättä toimi kunnolla. Tämä on seurausta ihmisen ja E. coli-kodonin mieltymysten epäsuhtaisuudesta. Jotkin ihmisillä yleisesti käytetyt kodonit eivät ole lainkaan yleisiä E. coli-bakteereissa ja päinvastoin. Translatoitaessa näitä kodoneja ribosomi saattaa siksi sakkautua sopimattomiin paikkoihin tai se ei läpäise koko transkriptiota, jolloin muodostuu vastaavasti epäfunktionaalisia proteiineja ja proteiinifragmentteja.
kodonin käytön bias – kodonin optimoinnin ongelman ratkaiseminen ja vaihtoehtoisen tRNAs: n ilmentyminen
kodonin optimointi
edullisella DNA-synteesillä yksi ensisijainen tapa, jolla tutkijat ratkaisevat kodonin valinnan ongelman, on uudelleensyntetisoida geenejä siten, että niiden kodonit sopivat paremmin halutulle ekspressio-isännälle. Tätä kutsutaan ” kodonin optimoinniksi.”Vaikka tämä on teoriassa yksinkertaista, se ei ole niin helppoa kuin miltä se kuulostaa. Suhteellisen lyhyillekin peptideille voi olla monia mahdollisia tapoja koodata niitä, eikä ”sopivan” kodonin muodostaminen ole välttämättä itsestään selvää.
voisi ajatella: ”hölynpölyä! Minun pitäisi vain valita kodoni, jossa on isäntäorganismini runsain varautuneiden trnojen allas jokaiselle aminohapolle, jonka haluaisin koodata,” mutta kuten edellä on kuvattu, kaikkia proteiinin alueita ei välttämättä pitäisi kääntää nopeasti tuottamaan proteiinia, joka toimii oikein.
silloin voisi ajatella: ”Okei, varmistan vain, että isännälle valitsemieni kodonien pitoisuudet vastaavat alkuperäisissä organismeissa käytettyjen kodonien pitoisuuksia.”Tämä on mahdollisesti parempi idea ja sitä on käytetty menestyksekkäästi aiemmin (Angov et al., 2008), mutta on vielä monia muita ominaisuuksia huomioon suunniteltaessa koko geeni. Ei-tyhjentävä luettelo sisältää:
- kodonin runsaus suhteessa kognitiotrna: n runsauteen
- toistuvat sekvenssit
- Rajoituspaikat
- sekvenssit, jotka ovat alttiita luomaan sekundaarirakenteita RNA: n transkriptioissa
- vaikutukset transkriptioon (muista, että kyse ei ole pelkästään translaatiosta – esim. kodonin valinta saattaa keskeyttää transkriptiotekijän sitoutumispaikat)
kuten voitte kuvitella, ihmisten ei ole helppoa tasapainottaa kaikkia näitä tekijöitä yksin. Onneksi monet tutkijat ovat luoneet kodonin optimointialgoritmeja ja DNA-synteesin yrityksiä, kuten IDT ja genscript host online kodonin optimointityökalut. Muista, että vain koska optimoit geenin yhdellä näistä työkaluista, se ei välttämättä tarkoita, että geeni tulee ilmaista hyvin. Jos saat hyvän ilmaisun, sinun pitäisi myös toiminnallisesti analysoida tuotettu proteiini sen varmistamiseksi, että se on taittunut oikein.
saatat pystyä välttämään kiinnostavien geenien kodonin optimointia tilaamalla niitä sisältäviä plasmideja Addgenesta. Jos Addgenen plasmidissa on geeni, joka on kodoniksi optimoitu tietylle organismille, tämä tulee joskus (mutta ei aina) huomatuksi plasmidisivun ”mutaatio” – kentässä (katso esimerkiksi plasmid 87904). Koska monilla addgenesta saatavilla plasmideilla on nyt täydelliset sekvenssitiedot, suosittelemme analysoimaan suoraan geenisekvenssejä kodonin optimointia ja sopivuutta expression-isännällesi ennen kuin käytät niitä kokeissasi.
vaihtoehtoisen tRNAs: n ilmentyminen
jos sinulla ei ole aikaa tai varoja syntetisoida kodonioptimoitua versiota kiinnostavasta geenistäsi, on mahdollista yliekspressoida alhaisen runsauden trnas: ia ilmentymässäsi ja siten lisätä niiden runsautta. Esimerkiksi kaupalliset Rosetta-E. coli-kannat ilmentävät erilaisia trnoja, joita tavallisesti esiintyy vähän E. coli-bakteereissa.
lisä-trnojen tuottamisen etuna on se, että samaa ekspressiojärjestelmää voi käyttää monille eri geeneille ilman, että tarvitsee luoda uusia konstruktioita. Kuitenkin, johtuen ongelmista, kuten Epäsuhtaiset käännösnopeudet ja mahdolliset vaikutukset solujen kasvuun, jopa isännät tuottavat vaihtoehtoisia tRNAs ei välttämättä ilmaista riittävästi proteiinisi kiinnostaa.
riippumatta siitä, minkä menetelmän valitset kodonin valintaan liittyvien ongelmien ratkaisemiseksi, sinulla pitäisi olla jokin menetelmä, jolla varmistat tuottamiesi proteiinien toimivan oikein. Yli-ilmentymä voi johtaa liukenemattomien, toimimattomien proteiinilevyjen tuotantoon, joita kutsutaan inkluusioelimiksi, jotka yleensä eriytyvät solupelletin kanssa puhdistusmenettelyjen aikana. Vaikka tuottaisit suuren määrän proteiinia expression-isännässäsi, sinun pitäisi suorittaa toiminnallinen määritys varmistaaksesi, että proteiinisi ei muodosta inkluusioelimiä ja taittuu oikein.
1. Angov, Evelina ym. ”Heterologista proteiiniekspressiota tehostetaan harmonisoimalla kohdegeenin kodonin käyttötaajuuksia ekspressioisännän taajuuksien kanssa.”PloS one 3.5 (2008): e2189. PubMed PMID: 18478103. PubMed Central Pmcid: PMC2364656.
2. Dittmar, Kimberly A., et al. ”Trna-isoakkeptorien selektiivinen lataus, joka johtuu aminohappojen nälkiintymisestä.”EMBO reports 6.2 (2005): 151-157. PubMed PMID: 15678157. PubMed Central Pmcid: PMC1299251.
3. Emilsson, Valur ja Charles G. Kurland. ”Kasvunopeuden riippuvuus siirtäjä-RNA: n runsaudesta Escherichia colissa.”The EMBO journal 9.13 (1990): 4359-4366. PubMed PMID: 2265611. PubMed Central Pmcid: PMC552224.
4. Gustafsson, Claes, Sridhar Govindarajan ja Jeremy Minshull. ”Kodonin bias ja heterologinen proteiiniekspressio.”Trends in biotechnology 22.7 (2004): 346-353. PubMed PMID: 15245907.
5. Maertens, Barbara ym. ”Gene optimization mechanisms:a multi-geeni tutkimus paljastaa korkea onnistumisprosentti täyspitkä ihmisen proteiineja ilmaistuna Escherichia coli.”Proteiinitiede 19.7 (2010): 1312-1326. PubMed PMID: 20506237. PubMed Central Pmcid: PMC2970903.
6. Pechmann, Sebastian ja Judith Frydman. ”Kodonioptimaalisuuden evolutiivinen säilyminen paljastaa cotranslationaalisen taittelun piilotetut allekirjoitukset.”Nature structural & molecular biology20.2 (2013): 237. PubMed PMID: 23262490. PubMed Central Pmcid: PMC3565066.
7. Quax, Tessa EF, et al. ”Kodonin bias keinona hienosäätää geenien ilmentymistä.”Molecular cell 59.2 (2015): 149-161. PubMed PMID: 26186290. PubMed Central Pmcid: PMC4794256.
- tämä katsaus antaa hyvän yleiskuvan kodonin käytön vinoudesta
8. Tuller, Tamir ym. ”Käännöstehokkuus määräytyy sekä kodonin vinouden että taittoenergian perusteella.”Proceedings of the National Academy of Sciences 107.8 (2010): 3645-3650. PubMed PMID: 20133581. PubMed Central Pmcid: PMC2840511.