1 Johdanto
transmembrane proteins (Tmps) – geenit muodostavat 20-30% useimmista genomeista (Wallin & Heijne, 1998). Näin ollen niiden rakenteiden ja toimintatapojen määrittely on erittäin tärkeää. Käytettävissä olevien korkean resoluution TMP-rakenteiden määrä on kuitenkin suhteellisen pieni (KS.Stephen Whiten www-sivu; http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/). Kaksi selitystä, joita usein esitetään vaikeudelle saada hyvin diffraktoivia tmp: n kiteitä käytettäväksi Röntgendiffraktiotutkimuksissa, ovat 1) tmp: t ovat rakenteellisesti dynaamisia, ja niiden joustavat alueet vaikeuttavat proteiinin yhtenäistä konformaatiota, joka vaaditaan pakkaamiseen kiteeseen; ja 2) tmp: n transmembraanisten alueiden pinnat eivät osallistu yhtä herkästi kuin globulaaristen liukoisten proteiinien pinnat proteiinien ja proteiinien vuorovaikutukseen, joita tarvitaan Kiteen pakkaamiseen. Stabiilin liukoisen proteiinin tuominen tmp: n pinta-altistetulle alueelle tarjoaa keinon mahdollisesti kiertää molemmat näistä ongelmista, koska tällainen lisäys tmp: n sisäiseen paikkaan voi vähentää yleistä joustavuutta ja koska helposti kiteytyvän liukoisen domeenin läsnäolo voi tarjota kiteytymisen edellyttämiä intermolekulaarisia kontakteja (Chun et al., 2012; Engel, Chen, & Privé, 2002).
T4-lysotsyymin (T4L) fuusio tmps: n sisäisissä paikoissa on tähän mennessä tarjonnut onnistuneen lähestymistavan tärkeän gpcr: n superperheen (Cherezov et al., 2007; Chien et al., 2010; Dore et al., 2014; Fenalti et al., 2014; Granier ym., 2012; Haga et al., 2012; Hanson et al., 2012; Hollenstein et al., 2013; Jaakola ym., 2008; Kruse ym., 2012; Manglik et al., 2012; Rosenbaum et al., 2007, 2011; Shimamura et al., 2011; Tan et al., 2013; Wacker ym., 2013; Wang et al., 2013; White et al., 2012; Wu et al., 2010, 2012; Xu ym., 2011; Zhang et al., 2012). Samankaltaiset lämpöstabilisoidun aposytokromi b: n sisäiset fuusiot (Wacker et al., 2013; Wang et al., 2013; Zhang, Zhang, Gao, Paoletta et al., 2014; Zhang, Zhang, Gao, Zhang, et al., 2014)ja rubredoxin (Tan et al., 2013) ovat tuottaneet myös GPCR-rakenteita. Lisäksi useita GPCR-rakenteita on saatu kiteyttämällä konstruktioita, joissa stabilisoiva proteiinikumppani fuusioitui reseptorisarjan n-terminukseen eikä sisäiseen asentoon (Fenalti et al., 2014; Rasmussen, Choi, et al., 2011; Rasmussen, DeVree, et al., 2011; Siu et al., 2013; Thompson ym., 2012; Wu et al., 2014), mikä viittaa siihen, että fuusioproteiinien rooli intermolekulaaristen kontaktien muodostumisen helpottamisessa voi olla tärkeämpi kiteytymisen edistämisessä kuin tmp: n joustavuuden vähentäminen. Vaihtoehtoisiin lähestymistapoihin gpcr-rakenteiden saamiseksi, joihin ei liity fuusioproteiinien käyttöä, on sisältynyt kokristallointi antireseptorivasta-aineilla (Kruse ym., 2013; Rasmussen, Choi, et al., 2011; Rasmussen et al., 2007; Rasmussen, DeVree, et al., 2011; Ring et al., 2013) ja kiteyttämällä gpcr-variantteja, jotka on termostatisoitu ottamalla käyttöön pistemutaatioita ja deleetioita (Egloff et al., 2014; Scott, Kummer, Tremmel, & Pluckthun, 2013; Tate, 2012). Itse asiassa useimmissa fuusioproteiinia sisältävissä gpcr-muunnoksissa, joita käytetään onnistuneeseen rakenteen määritykseen, on myös pistemutaatioita ja katkelmia, joiden tarkoituksena on parantaa proteiinin stabiilisuutta ja vähentää joustavuutta.
stabiilien liukoisten proteiinien lisääminen tmps: ään kiteytymisen edistämiseksi on yleensä suoritettu jäämien lisäämisenä tai korvaamisena GPCRs: n kolmannessa solunsisäisessä silmukassa (IC3). Tämä perustuu odotukseen, että tämä alue reseptoreissa on joustava ja voi ohjata ympäröivien helicien suhteellista liikettä (Rosenbaum et al., 2007), sekä vähentää todennäköisyyttä, että fuusio kumppani häiritsee yleistä GPCR rakenne (Chun et al., 2012). Vaikka tällaiset lisäykset eivät usein häiritse reseptorien yleisiä rakenteita (jotka perustuvat ainakin joidenkin ligandien sitoutumisaffiniteetin säilyttämiseen fuusiorakenteiden avulla), ne johtavat yleensä kykyyn aktivoida kognitiivinen trimeerinen g-Proteiini (Rosenbaum et al., 2007), mikä ei ole yllättävää, koska IC3-silmukka on usein funktionaalisten vuorovaikutusten paikka GPCRs: n ja trimeeristen G-proteiinien välillä, jotka ovat niiden välittömiä loppupään efektoreita. Lisäksi kriteerit, jotka koskevat fuusioproteiinien insertiokohtien määrittämistä ja niiden korvaaman reseptorisekvenssin määrän määrittämistä, eivät ole hyvin selvillä. Onnistuneen fuusion on tarjottava optimaalinen ottelu lisättävän proteiinin n – ja C-termiinin ja gpcr: n (Chun et al., 2012; Engel ym., 2002). Näin ollen hyödyllisen fuusion luominen voi vaatia fuusioituneiden geenien synteesiä tai useiden versioiden rakentamista (Rosenbaum et al., 2007).
tässä kuvataan strategiaa, jolla luodaan ja seulotaan reseptorin muunnelmakirjasto, joka sisältää T4L: n lisäyksiä kolmannen solunsisäisen silmukan (IC3) eri kohdissa aminohappojäämien eri määrän korvaamiseksi silmukkasekvenssissä (Mathew, Ding, Naider, & Dumont, 2013). Ilmaisemalla reseptoreita hiivassa on mahdollista luoda satunnaistettuja kirjastoja variantteja, joissa on lysotsyymi-insertioita, ja suoraan seuloa konstruktioita, joilla on maksimaaliset kokonaisilmaisutasot, ligandien sitoutumispaikkojen määrä solun pinnalla ja jopa reseptoritoiminta, määritettynä kognaatti G-proteiinin aktivoinnin perusteella. Lähestymistavat onnistuivat tunnistamaan reseptorit IC3-silmukan insertioilla, jotka säilyttävät lähes täyden signalointitoiminnon. Tämä viittaa siihen, että kun T4L-molekyyli kiinnittyy sopivien linkitysjaksojen kautta, se voidaan työntää tähän silmukkaan estämättä G-proteiinin pääsyä aktivoidun reseptorin merkityksellisille pinnoille.
kuvatut protokollat on kehitetty käyttäen Ste2p: tä, Saccharomyces cerevisiae-hiivan endogeenistä GPCR: ää, jota käytetään tractable-alkujärjestelmänä, jolle ei ole vielä saatavilla kolmiulotteista rakennetta. Kuitenkin, samanlaisia lähestymistapoja voitaisiin käyttää tunnistamaan insertio sisältävät variantit lukuisia nisäkkäiden GPCRs jotka on raportoitu pystyvän aktivoimaan hiiva feromoni vastaus reitti (Brown et al., 2000; Dowell & Brown, 2009; King, Dohlman, Thorner, Caron, & Lefkowitz, 1990; Pausch, 1997) tai muihin TMPs: ään, joiden funktio on mahdollista määrittää ehjissä soluissa. Lisäksi hiivalajeja on käytetty ilmaisujärjestelminä gpcrs: ien ja muiden TMPs: ien rakenteen määrittämisessä (Clark et al., 2010), mukaan lukien ihmisen H1-histamiinireseptorin kiderakenteen määrittämiseen (Shimamura et al., 2011; Shiroishi et al., 2011). Ste2p on hiivan paritteluferomoni α-tekijän eli 13-jäämäpeptidin reseptori. Tämän ligandin sitoutuminen johtaa sytoplasmaisen heterotrimeerisen G-proteiinin aktivoitumiseen, joka puolestaan aktivoi KARTTAKINAASIREITIN, mikä johtaa lopulta transkriptiovasteisiin, solun muodon muutoksiin, solusyklin pysähtymiseen ja fuusioitumiseen vastakkaisen pariutumistyypin hiivasolujen kanssa.