eredmények és megbeszélések
A PCR-RFLP analízis az in silico analízissel kompatibilis restrikciós mintákat mutatott ki. Minden kutya farok fejlődési bemutatott ugyanazt a mintát (3 fragmentumok, 2 látható sávok), amely eltér a bemutatott kutyák normál farok (2 fragmentumok, 1 látható sáv) (ábra.1). Egy másik, szintén PCR-RFLP alapú vizsgálatot sikeresen alkalmaztak ugyanazon mutáció azonosítására a kutyák t génjében, de poliakrilamid gélelektroforézis rendszerrel (Gruszczynska & Czapla 2011). A poliakrilamid gélelektroforézis teljesítménye javíthatja a sávok felbontását a DNS-fragmensekhez képest jelen vizsgálatban. A gyakorlatiasság azonban csökken, mivel ez a rendszer munkaigényesebb. Jelen tanulmányban, annak ellenére, hogy az emésztés után keletkezett összes DNS-fragmenst nem lehetett vizualizálni, agarózgél-elektroforézissel könnyen meg lehetett különböztetni a genotípusokat.
Fig.1. PCR-RFLP a C189G mutáció kimutatására. Az alappárok markere (M), az érintett kutyák – rövid farok (1-7) és az állat normál farokkal (8).
a szekvenált minták analízisében a C (citozin) g (guanin) heterozigozitást csak a farokdeformációval rendelkező kutyáknál figyelték meg az exon 189 nukleotidjában. A mutáció helye a Genbankban rendelkezésre álló t gén mRNS szekvencián alapult (csatlakozási szám: AJ245513).
az in silico analízis során a 63 aminosav izoleucin-metioninná történő átalakulását is megfigyelték. Az ebben a vizsgálatban kapott összes DNS-szekvenciát a GenBank-ban helyezték el csatlakozási számok alatt: MF495488 (rövid farok), MF495489 (farok hiánya), MF495490 (farok hiánya) és MF495491 (normál farok).
bár a jelenlegi állapotra csak egy genotípust találtak (Cg a farokfejlődéssel rendelkező állatok esetében), fenotípusos variációt figyeltek meg az érintett kutyáknál, ami a farok mérete. Egyes állatok rövid farokkal rendelkeztek (körülbelül 3-4 csigolya), mások farok hiányát mutatták (körülbelül 1-2 csigolya) (ábra.2). Hasonló fenotípusokat Haworth et al. (2001) kutyák. Bár ennek magyarázata a kutyáknál még nem ismert, Buckingham et al. (2013), a macskák veleszületett farokméretének variációját tanulmányozva bizonyítékot talált a T gén több mutációja által okozott haploinsufficienciára. A C. 1199delc, a c.1169delc és a c.998delT mutációk a génexpresszió különböző szintjeihez kapcsolódtak, ami megmagyarázhatja a különböző fenotípusokat a farok malformációval rendelkező kutyák között (Buckingham et al. 2013).
Fig.2. C189g mutációt hordozó kutya a T génben. B) ugyanabból az alomból származó kutya C189G mutáció nélkül.
a mutáció örökletes jellegét a heredogram analízis bizonyítja (ábra.3) a vizsgált alom. Ellenőrizhető volt, hogy a mutáció autoszomális domináns öröklődési mintázattal rendelkezik-e. Jelen tanulmányban azonban nem találtak domináns homozigóta (GG) genotípust, megerősítve azokat a megfigyeléseket, amelyek szerint homozigózis esetén a mutált T gén magzati halált okoz (Haworth et al. 2001). Hytonen et al. (2009) megfigyelte, hogy a normál farkú állatok (CC genotípus) közötti keresztezésekből származó almok 29%-kal nagyobbak voltak, mint a rosszul formált farokállatok (CG genotípus) közötti keresztezésből származó almok. Ez az eredmény összeegyeztethető a halálos allélokkal járó keresztezésekből származó utódok várható 25% – os csökkenésével.
Fig.3. Heredogram, amely a Labrador Retriever T génjében a C189g mutáció öröklődési mintázatát mutatja. Az anyai nagyszülők keresztezése (I), az érintett kutya alom és keresztezése normál hímmel (II) és az elemzett alom (III).
A T gén mutációit más fajokban, például egerekben és macskákban (Wilson et al. 1995, Buckingham et al. 2013). Néhányukban más változások is megfigyelhetők, mint például a macskák vizelet-és széklet-inkontinenciája (Robinson 1993). Kutyáknál azonban a mai napig csak a farok rendellenességét figyelték meg heterozigóta állatokban (CG) (Indrebo et al. 2008). Bár egyes kutyafajták esetében a” farokfejlődési ” fenotípus nem volt összefüggésben a C189G mutációval (Boston Terrier, Angol Bulldog, King Charles Spániel, Miniatűr Schnauzer, Parson Russell Terrier és Rottweiler), az érintett fajták nagy száma ősi mutációra utal (Hytonen et al. 2009), jelen van az ősi kutyákban sok fajta kialakulása előtt. A fajok közötti keresztezés azonban hozzájárulhatott a mutáció diffúziójához is, mivel úgy tűnik, hogy a CG heterozigóta állatokban nincs libidó vagy reproduktív teljesítményváltozás. Egy másik tényező, amely hozzájárulhatott a mutáció diffúziójához, a farok nélküli kutyák reprodukciójában való alkalmazás volt, amikor az esztétikai caudectomia még megengedett volt. Ebben az időszakban valószínű, hogy sok farokagenezissel rendelkező állatot használtak szaporítóként, mivel egyes fajtáknál kívánatos volt a farok hiánya, hozzájárulva a mutáció diffúziójához.
jelenleg a caudectomia (műtéti farok eltávolítás) gyakorlata tiltott eljárás a világ számos országában, például az Európai Unióban és Brazíliában (Haworth et al. 2001, CFMV 2013). Az Európai Unió egyes országaiban a T gén C189G mutációjának azonosítására szolgáló genetikai teszteket használnak annak ellenőrzésére, hogy egyes fajtákban a farok hiánya veleszületett eredetű-e, vagy az állatok szabálytalan műtéti beavatkozáson estek át. A jelen vizsgálatban alkalmazott PCR-RFLP egyszerű és pontos módszer volt a mutáció azonosítására, és bizonyítékként használható az illegális caudectomia gyakorlat azonosítására.
a kutyák T génjében a C189G mutációval kapcsolatos információk szűkössége miatt nincs további információ annak más morfológiai vagy akár fiziológiai karakterekkel való összefüggéséről, ezért meg kell vizsgálni.