Gélszűrő kromatográfia

Gélszűrő kromatográfia Alkalmazások

a gélszűrő kromatográfia, a méretkizárási kromatográfia egyik típusa, felhasználható a mintában lévő molekulák és komplexek frakcionálására meghatározott mérettartományú frakciókká, az adott méretnél nagyobb összes molekula eltávolítására a mintából, vagy a két művelet kombinációjára. A gélszűrő kromatográfia alkalmazható vegyületek, például kis molekulák, fehérjék, fehérje komplexek, poliszacharidok és nukleinsavak elválasztására vizes oldatban. Ha mozgó fázisként szerves oldószert használunk, az eljárást ehelyett gél permeációs kromatográfiának nevezzük.

Gélszűrő kromatográfiát is lehet használni:

• molekulák és komplexek frakcionálása egy előre meghatározott mérettartományban
• Méretelemzés és meghatározás
• nagy fehérjék és komplexek eltávolítása
• Puffercsere
• sótalanítás
• kis molekulák, például nukleotidok, primerek, festékek és szennyező anyagok eltávolítása
• a minta tisztaságának értékelése
• a kötés elválasztása a nem kötött radioizotópoktól

a gélszűrő kromatográfiás közegek a fenti felhasználások mindegyikéhez előrecsomagolt gravitációs áramlású oszlopokban, Spin oszlopokban, alacsony nyomású és közepes nyomású kromatográfiás oszlopok és palackozott gyanták.

Gélszűrő kromatográfiás mechanizmus

gélszűrő kromatográfiás oszlopban az állófázis porózus mátrixból áll, a mobil fázis pedig a mátrixgyöngyök között áramló puffer. A gyöngyöknek meghatározott pórusmérettartományuk van, amelyet frakcionálási tartománynak neveznek. Azok a molekulák és komplexek, amelyek túl nagyok ahhoz, hogy belépjenek a pórusokba, a mobil fázisban maradnak, és a puffer áramlásával mozognak az oszlopon. Kisebb molekulák és komplexek, amelyek képesek a pórusokba mozogni, belépnek az állófázisba, és a gyöngyök pórusain keresztül hosszabb úton mozognak a gélszűrő oszlopon.

bármely molekula vagy komplex, amely egy adott gélszűrő kromatográfiás oszlop frakcionálási tartománya felett van, gyorsabban mozog az oszlopon, mint bármely olyan molekula, amely beléphet az állófázisba. Ezért a minta bármely alkotóeleme, amely meghaladja a frakcionálási tartományt, először eluálódik (az üres térfogatban), mielőtt bármi, ami a frakcionálási tartományba esik. Az a minimális méret, amely a mozgó fázisban marad, és nem lép be az állófázisba, kizárási határként ismert. A Bio-Rad gélszűrő kromatográfiás közeget és oszlopokat kínál, amelyek kizárási határértékei három nagyságrendben, 100 daltontól 100 000 daltonig (100 kDa) terjednek.

az állófázisba lépő molekulákat és komplexeket méretük szerint frakcionáljuk. A kisebb molekulák mélyen a pórusokba vándorolnak, és jobban retardálódnak, mint a nagyobb molekulák, amelyek nem olyan könnyen lépnek be a pórusokba, és így gyorsabban eluálódnak az oszlopból. Ez a különbség a pórusvándorlásban az alkatrészek méret szerinti frakcionálásához vezet, először a legnagyobb eluálással.

a sótalanításra, puffercserére és kis molekulák, például nukleotidok eltávolítására tervezett gélszűrő kromatográfiás oszlopokban a sók és a kis vegyületek könnyen bejutnak a pórusokba, retardálódnak és lassabban vándorolnak át az oszlopon, mint a nagyobb fehérjék vagy nukleinsavak. Ezért a mintában érdekelt komponenseket sók, nukleotidok stb. Az ezt a mechanizmust használó DNS-tisztító készletek gyakran tartalmaznak gélszűrő spin oszlopokat.

a felbontást, amelyet itt a méretfrakciók közötti határok élességeként határozunk meg, a gyöngy mérete és számos más tényező határozza meg. A kisebb gyöngyméret általában nagyobb felbontást eredményez egy gélszűrő kromatográfiás oszlopban. A kompakt molekulák gyorsabban diffundálnak az állófázison, mint a lineáris molekulák. A méretkizárást, a frakcionálási tartományt és az elúciós sebességet befolyásolja a pufferösszetétel, az ionos szilárdság és a pH. a fehérjék komplex keverékeinek frakcionálásához empirikusan meg kell határozni az elúciós időket és a méretkizárási határértékeket.

Gélszűrő kromatográfiás közeg

a gélszűrő kromatográfiás közeg fontos kritériuma, hogy a közeg inert legyen, és hogy a mintában semmi, vagy bármilyen puffer ne kötődjön a közeghez. Egy másik szempont az alkalmazott gélszűrő oszlop típusa, valamint az, hogy nyomás alatt álló kromatográfiás rendszerben vagy gravitációs áramlású vagy spin oszlopokban használják-e. Nyomás alatt álló kromatográfiás rendszer használata esetén mind az oszlopnak, mind a közegnek képesnek kell lennie az alkalmazott nyomás és áramlási sebesség elviselésére.

a gélszűrő kromatográfiához általánosan használt közegek agaróz-vagy poliakrilamid-gyöngyökön, dextrózon alapulnak gravitációs vagy alacsony nyomású rendszerekhez, valamint polimer gyantákon közepes nyomású rendszerekhez. A média kiválasztása az elválasztandó komponensek tulajdonságaitól és más kísérleti tényezőktől függ. A gélszűrő kromatográfiás közeg megválasztásának meghatározásakor az alábbiak általános szempontok:

• frakcionálási tartomány
• méret kizárási határ
• üzemi nyomás
• áramlási sebesség
• minta viszkozitás
• pH-tartomány
• Autoklávozhatóság
• tolerancia vízzel elegyedő szerves oldószerek; egyes minták jobban oldhatók víz-szerves keverékben
• tolerancia a mosószerekre, kaotróp szerekre, formamidra stb.
• üzemi hőmérséklet

a minták típusai, a közeg kiválasztása és a kromatográfiás rendszer beállítása határozza meg, hogy mely paraméterek a legfontosabbak egy adott tisztítási alkalmazáshoz.