2-D az elektroforézis az első dimenzióban elektroforézissel kezdődik, majd a molekulákat merőlegesen elválasztja az elsőtől, hogy elektroferogramot hozzon létre a második dimenzióban. Az első dimenzióban az elektroforézis során a molekulákat lineárisan választják el izoelektromos pontjuk szerint. A második dimenzióban a molekulákat ezután 90 fokon elválasztják az első elektroferogramtól a molekulatömeg szerint. Mivel nem valószínű, hogy két molekula két különböző tulajdonságban hasonló lesz, a molekulákat hatékonyabban választják el a 2-D elektroforézisben, mint az 1-D elektroforézisben.
a két dimenzió, amelyre a fehérjéket elválasztják ezzel a technikával, lehet izoelektromos pont, fehérje komplex tömeg natív állapotban vagy fehérje tömeg.
a fehérjék izoelektromos ponttal történő elválasztását izoelektromos fókuszálásnak (IEF) nevezzük. Ezáltal pH-gradienst alkalmazunk a gélre, és elektromos potenciált alkalmazunk a gélen, így az egyik vége pozitívabb, mint a másik. Az izoelektromos pontjukon kívül minden pH-értéknél a fehérjék töltődnek. Ha pozitív töltésűek, akkor a gél negatívabb vége felé húzódnak, ha negatív töltésűek, akkor a gél pozitívabb végére húzódnak. Az első dimenzióban alkalmazott fehérjék a gél mentén mozognak, és izoelektromos pontjukban halmozódnak fel; vagyis az a pont, ahol a fehérje teljes töltése 0 (semleges töltés).
a fehérjék sejtekben való működésének elemzéséhez elengedhetetlen az együttműködésük ismerete. Leggyakrabban a fehérjék komplexekben működnek együtt, hogy teljesen működőképesek legyenek. A sejt ezen organellaszervezetének elemzése olyan technikákat igényel, amelyek megőrzik a fehérje komplexek natív állapotát. A natív poliakrilamid gélelektroforézisben (native PAGE) a fehérjék natív állapotukban maradnak, és tömegüket, illetve komplexeik tömegét követve az elektromos mezőben elválasztják őket. A méret szerinti, nem pedig a nettó töltés szerinti elválasztás érdekében, mint az IEF-ben, a coomassie Brilliant Blue vagy a lítium-dodecil-szulfát alkalmazásával további töltés kerül a fehérjékbe. Az első dimenzió befejezése után a komplexeket megsemmisítik a denaturáló SDS-oldal alkalmazásával a második dimenzióban, ahol a fehérjéket, amelyekből a komplexek állnak, tömegük választja el egymástól.
a fehérjék tömeg szerinti elválasztása előtt nátrium-dodecil-szulfáttal (SDS) kezeljük őket más reagensekkel együtt (SDS-oldal 1-D-ben). Ez denaturálja a fehérjéket (vagyis hosszú, egyenes molekulákká bontja ki őket), és számos SDS molekulát köt meg, amelyek nagyjából arányosak a fehérje hosszával. Mivel egy fehérje hossza (kibontva) nagyjából arányos a tömegével, ez egyenértékű azzal, hogy azt mondja, hogy számos SDS molekulát nagyjából arányos a fehérje tömegével. Mivel az SDS molekulák negatív töltésűek, ennek az az eredménye, hogy az összes fehérje megközelítőleg azonos tömeg / töltés arányú lesz, mint egymás. Ezenkívül a fehérjék nem vándorolnak, ha nincs töltésük (az izoelektromos fókuszálási lépés eredményeként), ezért a fehérje bevonása az SDS-be (negatív töltésű) lehetővé teszi a fehérjék migrációját a második dimenzióban (SDS-oldal, nem kompatibilis az első dimenzióban való használatra, mivel töltődik, és nemionos vagy zwitterionos mosószert kell használni).a második dimenzióban ismét elektromos potenciált alkalmaznak, de az első mezőtől 90 fokos szögben. A fehérjéket a gél pozitívabb oldala vonzza (mert az SDS negatív töltésű) tömeg / töltés arányukkal arányosan. Mint korábban kifejtettük, ez az arány majdnem azonos lesz minden fehérje esetében. A fehérjék fejlődését súrlódási erők lassítják. A gél ezért úgy viselkedik, mint egy molekulaszűrő, amikor az áramot alkalmazzák, elválasztva a fehérjéket molekulatömegük alapján, nagyobb fehérjéket tartva fenn a gélben, és a kisebb fehérjék képesek átjutni a szitán, és elérni a gél alacsonyabb régióit.