hasonló genetikai kódot használ a legtöbb organizmus a Földön, de a különböző organizmusok eltérő preferenciákkal rendelkeznek a kodonokkal szemben, amelyeket specifikus aminosavak kódolására használnak. Ez azért lehetséges, mert minden kodonban 4 bázis (A, T, C és G) és 3 pozíció található. Ezért 64 lehetséges kodon létezik, de csak 20 aminosav és 3 stop kodon kódolható, így 41 kodon nincs elszámolva. Az eredmény redundancia; több kodon egyetlen aminosavat kódol. Az evolúciós korlátok meghatározták, hogy mely kodonokat használják előnyösen, amelyekben az organizmusok-az organizmusok kodonhasználati torzítással rendelkeznek.
számos kodontábla található, amelyek megmutatják, hogy mely kodonok mely aminosavakat kódolják (lásd a jobb oldali példát). Ilyen egyszerű szabályokkal azt gondolhatja, hogy könnyű kidolgozni egy működőképes DNS-szekvenciát, amely kódolja az érdeklődő peptidet, és előállítja ezt a peptidet a választott szervezetben. Sajnos a kodon preferenciák miatt nem lehet véletlenszerűen választani a lehetséges kodonok közül, és elvárják, hogy szekvenciája jól expresszálódjon bármely szervezetben.
tehát milyen evolúciós korlátok vezetnek ezekhez a preferenciákhoz, és mit tehetünk velük? Olvassa el, hogy megtudja!
miért különböznek az organizmusok kodonhasználati torzításai?
az organizmusok közötti változatos kodonpreferenciák okai nem teljesen ismertek, de néhány lehetséges ok a következők:
- metabolikus nyomás-sejtes erőforrásokra van szükség a tRNS-ek előállításához, amelyek felismerik a különböző kodonokat, helyesen módosítják a tRNS-eket, és feltöltik a tRNS-eket a megfelelő aminosavakkal. Ha egy organizmus csak a kodonok egy részhalmazát használja, akkor csak a feltöltött tRNS-ek egy részhalmazát kell előállítania, ezért kevesebb erőforrásra lehet szüksége a teljes fordítási folyamathoz. Például magas növekedési ütemű körülmények között az E. coli előnyben részesíti a tRNS-ek termelését, amelyek felismerik az erősen expresszált génekben található kodonokat (Emilsson and Kurland, 1990).
- a génexpresszió szabályozása génszekvencián keresztül – az alacsony bőségű vagy rosszul töltött tRNS-ek által kódolt kodonok által kódolt fehérjék alacsonyabb sebességgel állíthatók elő, mint a nagyon bőséges, töltött tRNS-ek által kódolt fehérjék. Például Tuller et al. megállapította, hogy a transzlációs hatékonyság jól korrelál a kodon torzításával mind az E. coli, mind az S. cerevisiae esetében.
- fehérje hajtogatás – ha egy fehérjét kodonok keveréke kódol erősen és rosszul töltött tRNS-ekkel, a fehérje különböző régiói eltérő sebességgel transzlálódhatnak. A riboszóma gyorsan mozog a bőséges, töltött tRNS-eket igénylő régiók mentén, de elakad az alacsony bőségű, rosszul töltött tRNS-eket igénylő régiókban. Amikor a riboszóma leáll, ez lehetőséget adhat a gyorsan lefordított régióknak a megfelelő hajtogatásra. Pechmann és Frydman például azt találták, hogy a nem optimális kodonok bizonyos szekunder struktúrákhoz kapcsolódnak 10 szorosan rokon élesztőtörzsben.
- alkalmazkodás a változó körülményekhez – az organizmusoknak gyakran különböző szinteken, különböző körülmények között kell expresszálniuk a géneket. Változatos kodonhasználattal egy szervezet megváltoztathatja, hogy mely fehérjék expresszálódnak erősen és melyek gyengén expresszálódnak specifikus tRNS-medencék létrehozásával és töltésével. Például az aminosav-bioszintetikus enzimeket kódoló génekben használt tRNS-ek előnyösen tölthetők az aminosav-éhezés során, így az aminosav-bioszintetikus enzimek nagyobb termelését eredményezik (Dittmar et al., 2005).
hogyan befolyásolja a kodonhasználat torzítása a kísérleteimet?
míg a kodon preferenciák nagyon hasznosak lehetnek az organizmusok számára, problematikusak lehetnek a kutatók számára, akik heterológ gazdaszervezetekben próbálnak fehérjéket expresszálni. Ha például egyszerűen felerősítünk egy érdekes gént az emberi genomból, előfordulhat, hogy egyáltalán nem expresszálódik az E. coli-ban (különféle adatbázisok találhatók a különböző organizmusok kodon preferenciáiról az interneten). Még akkor is, ha a gént lefordítják, előfordulhat, hogy nem működik megfelelően. Ez a humán és az E. coli kodon preferencia közötti eltérés eredménye. Az emberekben általánosan használt kodonok egyáltalán nem gyakoriak az E. coli-ban és fordítva. Ezeknek a kodonoknak a fordításakor a riboszóma ezért nem megfelelő helyeken elakadhat, vagy nem képes átjutni a teljes transzkriptumon, ami nem funkcionális fehérjék, illetve fehérjefragmensek képződését eredményezi.
a kodonhasználat bias – kodon optimalizálásának és az alternatív tRNS-ek expressziójának megoldása
kodon optimalizálás
az alacsony költségű DNS-szintézissel a kutatók egyik elsődleges módja a kodonválasztás problémájának megoldása a gének újraszintetizálása oly módon, hogy kodonjaik jobban megfeleljenek a kívánt expressziós gazdagépnek. Ez az úgynevezett ” kodon optimalizálás.”Bár elméletileg egyszerű, ez nem olyan egyszerű, mint amilyennek hangzik. Még a viszonylag rövid peptidek esetében is sokféle módon lehet kódolni őket, és hogy mi alkotja a “megfelelő” kodont, az nem feltétlenül nyilvánvaló.
azt gondolhatja: “nonszensz! Csak azt a kodont kell választanom, amelyben a gazdaszervezetemben a legtöbb feltöltött tRNS található minden olyan aminosavhoz, amelyet kódolni szeretnék,” de, mint fentebb leírtuk, a fehérje minden régióját nem feltétlenül kell gyorsan lefordítani, hogy megfelelően működő fehérjét termeljen.
ezután azt gondolhatja: “oké, csak megbizonyosodom arról, hogy a gazdaszervezet számára választott kodonok mennyisége megegyezik-e az őshonos organizmusban használt kodonok bőségével.”Ez valószínűleg egy jobb ötlet, és sikeresen alkalmazták a múltban (Angov et al., 2008), de még mindig sok más funkciót kell figyelembe venni a teljes gén megtervezésekor. A nem kimerítő lista a következőket tartalmazza:
- Kodonbőség a rokon tRNS-bőséghez viszonyítva
- ismétlődő szekvenciák
- restrikciós helyek
- szekvenciák, amelyek hajlamosak másodlagos struktúrák létrehozására az RNS-átiratokban
- a transzkripcióra gyakorolt hatások (ne feledje ,ez nem minden a transzlációról szól – pl. a kodonválasztás megszakíthatja a transzkripciós faktor kötőhelyeit)
mint gondolnád, Az emberek számára nem könnyű ezeket a tényezőket önmagában egyensúlyba hozni. Szerencsére sok kutató kodonoptimalizáló algoritmusokat és DNS-szintézis cégeket hozott létre, mint például az IDT és a GenScript host online kodonoptimalizáló eszközöket. Ne feledje, hogy csak azért, mert optimalizálja a gént ezen eszközök egyikével, ez nem feltétlenül jelenti azt, hogy a gén jól expresszálódik. Ha jó kifejezést kap, akkor funkcionálisan elemeznie kell a termelt fehérjét is annak biztosítása érdekében, hogy megfelelően hajtogatott legyen.
lehet, hogy elkerülheti az érdeklődésre számot tartó gének kodonjának optimalizálását azáltal, hogy megrendeli őket tartalmazó plazmidokat az Addgene-től. Ha az Addgene plazmidja olyan gént tartalmaz, amelyet kodonra optimalizáltak egy adott organizmus számára, akkor ezt néha (de nem mindig) meg kell jegyezni a plazmid oldal “mutáció” mezőjében (lásd plasmid 87904 például). Mivel az Addgene-től elérhető sok plazmid teljes szekvenciaadattal rendelkezik, javasoljuk, hogy közvetlenül elemezze a génszekvenciákat a kodon optimalizálása és az expressziós gazdagépre való alkalmasság érdekében, mielőtt felhasználná őket a kísérletekben.
alternatív tRNS-ek kifejeződése
ha nincs időd vagy pénzed az érdeklődésre számot tartó gén kodon optimalizált változatának szintetizálására, lehetséges, hogy túlexpresszálod az alacsony abundanciájú tRNS-eket az expression host-ban, és ezáltal növeled azok bőségét. Például a kereskedelmi Rosetta E. coli törzsek különféle tRNS-eket fejeznek ki, amelyek általában alacsony mennyiségben találhatók meg az E. coliban.
a további tRNS-ek előállításának előnye, hogy ugyanazt az expressziós rendszert számos különböző génhez használhatja anélkül, hogy új konstrukciókat kellene létrehoznia. Azonban az olyan problémák miatt, mint a nem megfelelő transzlációs arány és a sejtnövekedésre gyakorolt lehetséges hatások, még az alternatív tRNS-eket termelő gazdaszervezetek sem biztos, hogy elegendő mennyiséget expresszálnak az Ön számára érdekes fehérjéből.
függetlenül attól, hogy melyik módszert választja a kodonválasztás körüli problémák leküzdésére, rendelkeznie kell valamilyen módszerrel annak biztosítására, hogy az előállított fehérjék megfelelően működjenek. A túlexpresszió oldhatatlan, nem funkcionális fehérjegömbök képződését eredményezheti, amelyeket inklúziós testeknek neveznek, amelyek általában elkülönülnek a sejtpellettel a tisztítási eljárások során. Még akkor is, ha nagy mennyiségű fehérjét termel a választott expressziós gazdaszervezetben, funkcionális vizsgálatot kell végeznie, hogy megbizonyosodjon arról, hogy a fehérje nem képezi-e a befogadó testeket, és megfelelően hajtogat.
1. Angov, Evelina, et al. “A heterológ fehérje expresszióját fokozza a célgén kodonhasználati gyakoriságának harmonizálása az expressziós gazdaszervezetével.”PloS one 3.5 (2008): e2189. PubMed PMID: 18478103. PubMed központi PMCID: PMC2364656.
2. Dittmar, Kimberly A., et al. “Az aminosav éhezés által kiváltott tRNS izoacceptorok szelektív töltése.”EMBO jelentések 6.2 (2005): 151-157. PubMed PMID: 15678157. PubMed központi PMCID: PMC1299251.
3. Emilsson, Valur és Charles G. Kurland. “A transzfer RNS bőségének növekedési sebességfüggése Escherichia coliban.”Az EMBO folyóirat 9.13 (1990): 4359-4366. PubMed PMID: 2265611. PubMed központi PMCID: PMC552224.
4. Gustafsson, Claes, Sridhar Govindarajan és Jeremy Minshull. “Kodon torzítás és heterológ fehérje expresszió.”A biotechnológia trendjei 22.7 (2004): 346-353. PubMed PMID: 15245907.
5. Maertens, Barbara, et al. “Génoptimalizálási mechanizmusok: egy többgénes vizsgálat az Escherichia coli‐ban expresszált teljes hosszúságú humán fehérjék magas sikerességi arányát tárja fel.”Protein Science 19.7 (2010): 1312-1326. PubMed PMID: 20506237. PubMed központi PMCID: PMC2970903.
6. Pechmann, Sebastian és Judith Frydman. “A kodon-optimalitás evolúciós megőrzése feltárja a kotranszlációs hajtogatás rejtett aláírásait.”Természet szerkezeti & molekuláris biológia20.2 (2013): 237. PubMed PMID: 23262490. PubMed központi PMCID: PMC3565066.
7. Quax, Tessa EF, et al. “A kodon elfogultsága a génexpresszió finomhangolásának eszköze.”Molekuláris sejt 59.2 (2015): 149-161. PubMed PMID: 26186290. PubMed központi PMCID: PMC4794256.
- ez az áttekintés nagyszerű áttekintést nyújt a kodonhasználati torzításról
8. Tuller, Tamir, et al. “A fordítás hatékonyságát mind a kodon torzítása, mind a hajtogatási energia határozza meg.”A Nemzeti Tudományos Akadémia folyóiratai 107.8 (2010): 3645-3650. PubMed PMID: 20133581. PubMed központi PMCID: PMC2840511.