klasszikusan a radioimmunoassay elvégzéséhez egy antigén ismert mennyiségét radioaktívvá teszik, gyakran úgy, hogy a jód gamma-radioaktív izotópjaival, például a 125-I-vel jelölik tirozin. Ezt a radioaktívan jelölt antigént ezután összekeverjük az adott antigén ismert mennyiségű antitestjével, és ennek eredményeként a kettő specifikusan kötődik egymáshoz. Ezután egy beteg szérummintáját adjuk hozzá, amely ismeretlen mennyiségű azonos antigént tartalmaz. Ez azt eredményezi, hogy a szérumból származó jelöletlen (vagy “hideg”) antigén versenyez a radioaktívan jelölt antigénnel (“forró”) az antitestkötő helyekért. A “hideg” antigén koncentrációjának növekedésével több kötődik az antitesthez, kiszorítva a radioizotópos variánst, és csökkentve az antitesthez kötött radioizotópos antigén arányát a szabad radioizotópos antigénhez. A kötött antigéneket ezután elválasztjuk, és a felülúszóban maradt szabad(nem kötött) antigén radioaktivitását gamma-számlálóval mérjük.
ez a módszer elvileg bármely biológiai molekulára alkalmazható, és nem korlátozódik a szérumantigénekre, és nem szükséges a szabad antigén mérésére szolgáló közvetett módszert alkalmazni a befogott antigén közvetlen mérése helyett. Például, ha nem kívánatos vagy nem lehetséges az érdekes antigén vagy célmolekula radioizotópos megjelölése, akkor RIA-t lehet végezni, ha két különböző antitest áll rendelkezésre, amelyek felismerik a célpontot, és a cél elég nagy (például egy fehérje) ahhoz, hogy több epitópot mutasson az antitesteknek. Az egyik antitestet a fentiek szerint radioizotóppal jelöljük, míg a másik változatlan marad. A RIA azzal kezdődik, hogy a” hideg ” jelöletlen antitest kölcsönhatásba lép és kötődik az oldatban lévő célmolekulához. Előnyösen ezt a címkézetlen antitestet valamilyen módon immobilizáljuk, például agarózgyöngyhöz kapcsoljuk, felületre bevonjuk stb. Ezután a” forró ” radioaktívan jelölt antitest kölcsönhatásba léphet az első antitest-célmolekula komplextel. Kiterjedt mosás után megmérik a kötött radioaktív ellenanyag közvetlen mennyiségét, és a célmolekula mennyiségét úgy számszerűsítik, hogy összehasonlítják azt az egyidejűleg vizsgált referenciamennyiséggel. Ez a módszer elvileg hasonló a nem radioaktív szendvics ELISA módszerhez.