1 Bevezetés
a transzmembrán fehérjék (tmp) génjei a legtöbb Genom 20-30% – át teszik ki (Wallin & Heijne, 1998), és a sejtfiziológiában betöltött kritikus szerepük alapján a tmp-k a klinikailag hasznos gyógyszerek nagy részének célpontjai. Ezért rendkívül fontos a struktúrák és a hatásmechanizmusok meghatározása. A rendelkezésre álló nagy felbontású tmp-struktúrák száma azonban továbbra is viszonylag alacsony (lásd Stephen White weboldalát; http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/). A tmp-k jól diffraktáló kristályainak röntgendiffrakciós vizsgálatokhoz való megszerzésének nehézségeire gyakran hivatkoznak két magyarázat: (1) A tmp–k szerkezetileg dinamikusak, rugalmas régiókkal, amelyek megnehezítik a fehérje számára a kristályba csomagoláshoz szükséges egységes konformáció elfogadását; és (2) A tmp-k transzmembrán régióinak felületei nem vesznek részt olyan könnyen, mint a gömb alakú oldható fehérjék felületei a kristálycsomagoláshoz szükséges fehérje-fehérje kölcsönhatásokban. Stabil oldható fehérje bevezetése a tmp felületnek kitett régiójába lehetővé teszi mindkét probléma potenciálisan megkerülését, mivel egy ilyen beillesztés a tmp belső helyén csökkentheti az általános rugalmasságot, és mivel egy könnyen kristályosítható oldható domén jelenléte biztosítja a kristályosításhoz szükséges intermolekuláris érintkezőket (Chun et al., 2012; Engel, Chen, &Priv (2002).
a T4 lizozim (T4L) fúziója a tmp-k belső helyein a mai napig sikeres megközelítést biztosított a fontos GPCR szupercsalád különböző tagjainak szerkezetének meghatározásához (Cherezov et al., 2007; Chien et al., 2010; Dore et al., 2014; Fenalti et al., 2014; Granier et al., 2012; Haga et al., 2012; Hanson et al., 2012; Hollenstein et al., 2013; Jaakola et al., 2008; Kruse et al., 2012; Manglik et al., 2012; Rosenbaum et al., 2007, 2011; Shimamura et al., 2011; Tan et al., 2013; Wacker et al., 2013; Wang et al., 2013; White et al., 2012; Wu et al., 2010, 2012; Xu és munkatársai., 2011; Zhang et al., 2012). A termikusan stabilizált apocytochrome b hasonló belső fúziói (Wacker et al., 2013; Wang et al., 2013; Zhang, Zhang, Gao, Paoletta et al., 2014; Zhang, Zhang, Gao, Zhang, et al., 2014) és rubredoxin (Tan et al., 2013) GPCR struktúrákat is eredményeztek. Ezenkívül számos GPCR struktúrát kaptunk olyan konstrukciók kristályosításával, amelyekben a stabilizáló fehérje partner a receptor szekvencia N-terminálisán fuzionált, nem pedig belső helyzetben (Fenalti et al., 2014; Rasmussen, Choi, et al., 2011; Rasmussen, DeVree, et al., 2011; Siu et al., 2013; Thompson et al., 2012; Wu et al., 2014), ami arra utal, hogy a fúziós fehérjék szerepe az intermolekuláris kapcsolatok kialakulásának megkönnyítésében fontosabb lehet a kristályosodás elősegítésében, mint a TMP rugalmasságának csökkentése. Alternatív megközelítések a gpcr struktúrák megszerzéséhez, amelyek nem járnak fúziós fehérjék alkalmazásával, magukban foglalják a kokristályosítást anti-receptor antitestekkel (Kruse et al., 2013; Rasmussen, Choi, et al., 2011; Rasmussen et al., 2007; Rasmussen, DeVree, et al., 2011; Ring et al., 2013) és a pontmutációk és deléciók bevezetésével termosztatizált GPCR variánsok kristályosítása (Egloff et al., 2014; Scott, Kummer, Tremmel, & Pluckthun, 2013; Tate, 2012). Valójában a legtöbb fúziós fehérjét tartalmazó GPCR variáns, amelyet a szerkezet sikeres meghatározásához használtak, pontmutációkat és csonkolásokat is tartalmaz, amelyek célja a fehérje stabilitásának további növelése és a rugalmasság csökkentése.
stabil oldható fehérjék tmp-kbe történő behelyezését a kristályosodás elősegítése céljából általában a Gpcr-ek harmadik intracelluláris (IC3) hurokjában lévő maradékanyagok behelyezéseként vagy pótlásaként végezték. Ez azon az elváráson alapul, hogy ez a régió a receptorokban rugalmas és szabályozhatja a környező hélixek relatív mozgását (Rosenbaum et al., 2007), valamint csökkenti annak valószínűségét, hogy a fúziós partner beillesztése megzavarja az Általános GPCR struktúrát (Chun et al., 2012). Míg az ilyen Beillesztések gyakran nem zavarják meg a receptorok általános szerkezetét (a fúziós konstrukciók legalább néhány ligandumkötő affinitásának megtartása alapján), általában a rokon trimer g fehérje aktiválásának képességének elvesztését eredményezik (Rosenbaum et al., 2007), ami nem meglepő, mivel az IC3 hurok gyakran a Gpcr-ek és a trimer g fehérjék közötti funkcionális kölcsönhatások helyszíne, amelyek közvetlen downstream effektoraik. Továbbá a fúziós fehérjék beillesztésére szolgáló egyes csatlakozási helyek meghatározására és az általuk helyettesített receptorsz-szekvencia mennyiségének meghatározására vonatkozó kritériumok nem eléggé megalapozottak. A sikeres fúziónak optimális egyezést kell biztosítania a beillesztett fehérje N – és C-végének távolsága és orientációja, valamint a GPCR csatlakozási helyei között (Chun et al., 2012; Engel et al., 2002). Így egy hasznos fúzió létrehozásához szükség lehet a fuzionált gének több változatának szintézisére vagy felépítésére (Rosenbaum et al., 2007).
itt egy olyan receptor variáns formáinak könyvtárának létrehozására és szűrésére vonatkozó stratégiát írunk le, amely T4L inszerciókat tartalmaz a harmadik intracelluláris (IC3) hurok különböző pontjain, a hurok szekvenciában lévő aminosavmaradékok különböző számának helyettesítésére (Mathew, Ding, Naider, & Dumont, 2013). Az élesztőben lévő receptorok expresszálásával lehetséges a variánsok randomizált könyvtárainak létrehozása lizozim inszerciókkal, valamint a maximális teljes expressziós szinttel rendelkező konstrukciók közvetlen szűrése, a sejtfelszínen lévő ligandumkötő helyek száma, sőt a receptor funkció, amelyet a rokon g fehérje aktiválása alapján vizsgálnak. A megközelítések sikeresen azonosították az IC3 hurokba beillesztett receptorokat, amelyek majdnem teljes jelátviteli funkciót tartanak fenn. Ez arra utal, hogy ha megfelelő összekötő szekvenciákon keresztül kapcsolódik, a T4L molekula beilleszthető ebbe a hurokba anélkül, hogy megakadályozná a g fehérje hozzáférését az aktivált receptor releváns felületeihez.
a leírt protokollokat Ste2p-vel, a Saccharomyces cerevisiae élesztő endogén GPCR-jével fejlesztették ki kezelhető kezdeti rendszerként, amelyhez még nem áll rendelkezésre háromdimenziós szerkezet. Ugyanakkor hasonló megközelítések alkalmazhatók a számos emlős Gpcr beillesztést tartalmazó variánsainak azonosítására, amelyekről beszámoltak arról, hogy képesek aktiválni az élesztő feromon válaszútját (Brown et al., 2000; Dowell & Brown, 2009; King, Dohlman, Thorner, Caron, & Lefkowitz, 1990; Pausch, 1997), vagy más tmp-kre, amelyek esetében meg lehet vizsgálni az ép sejtek működését. Továbbá élesztőfajokat használtak expressziós rendszerként a Gpcr-ek és más tmp-k szerkezetének meghatározására (Clark et al., 2010), beleértve az emberi H1 hisztamin receptor kristályszerkezetének meghatározását (Shimamura et al., 2011; Shiroishi et al., 2011). Ste2p a receptor a élesztő párosító feromon-faktor, egy 13-maradék peptid. Ennek a ligandumnak a kötődése egy citoplazmatikus heterotrimer g fehérje aktiválódását eredményezi, amely viszont aktiválja a map kináz útvonalat, végül transzkripciós válaszokhoz, a sejt alakjának változásához, a sejtciklus leállításához és az ellenkező párzási típusú élesztősejtekkel való fúzióhoz vezet.