合成代謝経路を有する大腸菌BL21(DE3)におけるIPTGによる基質毒性の増悪

合成分解経路の変異体を有する大腸菌BL21(DE3)細胞によるTCPの生体変換

野生型ハロアルカンのいずれかを特徴とする合成経路の変異体デハロゲナーゼまたは26倍の触媒的により効率的な変異DHAA31は、大腸菌Bl21（De3）に導入されました。 このホストは、酵素もTCP経路の代謝産物は、その代謝ネットワークに自然に発生しないため、単一の細胞内で複数の遺伝子の調整可能な共発現を可能に これは、三つの経路成分の発現が直交的に操作することができる代謝クロストークの限られたリスクを持つ柔軟なシステムの構築をもたらした。 三つの以前に構築されたE. ｄｅｇＷｔ、ｄｅｇ３ １、およびｄｅｇ３ １ｏｐｔと命名された大腸菌ＢＬ２ １（ＤＥ３）分解剤を試験した（表１）。 大腸菌degWTは、0.2mM IPTGによる事前誘導後に決定されたように、それぞれ0.24：0.36：0.40の相対比で表される、hhecおよびEchAとともに野生型DhaAに基づくTCP経路の変 S1）。 株deg31とdeg31optは両方とも設計されたデハロゲナーゼDhaa31を特徴とするTCP経路を運ぶが、deg31の三つの酵素の相対比は0.14:0.41:0.45であり、deg31optでは0.63:0.16:0.21である。 ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）実験は、三つの経路酵素が一緒にすべての三つの分解者によって生成される総可溶性タン

前誘導(0.組換え株および宿主対照（表１）のそれぞれの休止細胞を、２ｍ Ｍ ＴＣＰを有するリン酸緩衝液中でインキュベートし、５時間間隔にわたるＴＣＰ生体内変換の時間経過を記録した（図１）。 1). 反応プロファイルは，ＴＣＰ脱ハロゲン化の初期速度，中間体の蓄積およびグリセロール形成の全体的効率に関する系統間の基本的な違いを明らかにした。 グリセロールの理論的濃度は、そうでなければEによって急速に利用される。 ｃｏｌｉは、経路の直交性のために、ＴＣＰの実験濃度および検出された中間体から計算することができる。 Deg31optは最速の最初のステップの恩恵を受けていますが（図。 1d)、最も高いグリセロール産生を有する最良のバランスのとれた経路はdeg31であった(図1d)。 1c）。 一方、degWTはTCP変換が遅いことに苦しんでいました（図。 1b)、有毒な基質への長期暴露、および不十分な経路出力。 予想されるように、ホストコントロール（対応する空のプラスミドを運ぶ、図。 1a)クローズドバッチシステムではTCPに対する活性を示さなかった。

三つのE. 大腸菌組換え体と合成経路を欠いている制御株は、全細胞触媒によるTCP生体内変換のフィットネスコストへの代謝負荷と基質/代謝産物毒性の寄与を研究するための適切なモデルシステムを表しています。

めっきによる代謝負荷および基質毒性効果の評価

めっきによって推定される細胞生存率は、代謝負荷およびTCP曝露によって引き起こされるス 大腸菌は0で事前誘導された分解を行う。2mM IPTGおよびホストコントロールは、2mM TCPの有無にかかわらず、リン酸緩衝液中でのインキュベーションの5時間の前後にメッ 生存細胞の割合は、インキュベーション後に計算した。

インキュベーション前のめっきから得られたデータ（Fig. （図２ａ）は、細胞に課される全体的な代謝負荷の個々の要素の別々の効果を示す。 プラスミドDNAと関連する選択マーカーの存在、IPTGの添加、および異種経路発現による負担を含むいくつかの要因は、毒性基質の添加前であっても並行して この段階で最も顕著な影響は、プラスミドの維持とDuetベクターからの選択マーカー遺伝子の関連する構成的発現だけでなく、IPTGの存在によるものでした。 ２つの中〜高コピーのプラスミドｐＣＤＦ（１細胞当たり２ ０〜４ ０コピー）およびｐＥＴＤｕｅｔ（１細胞当たり〜４ ０コピー）の存在は、生存率を５ ０％低下させた（Ｐ＜６ ８ １ ５＞０． 2a）。 空のプラスミドを用いた宿主対照の「前誘導」は、非誘導対照と比較して生存率をほぼ40％低下させた（P<0.01）。 大腸菌分解剤中の経路酵素の発現は、生存率をさらに約20％低下させた（P<0.05）。 DegWTとdeg31と比較してdeg31optの生存率の追加の減少は、潜在的に三つの組換え体の間で抗生物質選択マーカーの違いに起因することができます。

ＴＣＰの有無にかかわらず、５時間インキュベーション後に収集されたデータ（図５）。 2bおよび追加ファイル1:Fig. S2）は、いくつかの予期しない観測を含んでいた。 驚くべきことに、TCP（最初に2mMの濃度で追加）は、空のプラスミドを保有する非誘導対照細胞の生存率にわずかまたは無視できる影響を持っていた; これらの細胞とＴＣＰもＩＰＴＧも曝露されなかった宿主コントロールとの間に生存率に有意差はなかった。 これは、TCPが大腸菌BL21（DE3）およびA.radiobacter AD1またはPseudomonas putida MC4などの天然宿主の増殖細胞を、ここで使用されているものよりも50％低い濃度でも強く阻害する 一方、IPTGの有害な影響は統計的に有意であった（P<0.01）（図10）。 2bおよび追加ファイル1:Fig. S2）。 最も顕著な観察は、IPTGで事前に誘導された後、TCPに曝露された細胞の相対的生存率が、どちらの物質にも曝露されなかった宿主対照のそれよりもほぼ90％ 2b）。 この劇的な生存能力の喪失は、2つの化合物の個々の効果の単純な合計に対応していません;IPTGがTCPの毒性を悪化させたことは明らかです。 IPTGがTCPの毒性を悪化させ、その逆もないという事実は、合成生分解経路を有する三つの組換え体をめっきすることによって確認された（図。 2b）。 これらの分解器はTCP分解のための機能的経路を有していたので、その存在をより良好に許容することができた。 重要なことは、経路酵素によるＴＣＰの変換が速いほど、分解者の生存率が高くなることである。 Tcpの急速な初期変換を達成したが、中間体DCPとGDLのかなりの量を蓄積deg31optは、5hインキュベーションほぼ同様に基板にさらされていなかったホス これらのデータは、以前に報告された成長停止試験の結果と一致しており、これはＴＣＰが経路中で最も毒性のある化合物であることを示した。

マルチパラメータフローサイトメトリーによる代謝負荷および基質毒性効果の評価

マルチパラメータフローサイトメトリーは、サンプル調製直後にいくつかの生化学的および物理的変数を同時に決定することができるため、めっきによって得ることができるよりも細胞の生理学的状態に関するより正確な情報を提供する必要がある。 この技術はまた、細菌集団の異質性に関する重要な情報を提供する。 メッキとは異なり、集団の一部が致死下損傷を経験し、成長する能力を失った場合には、元の培養物中の生存細胞の数を過小評価しない。

三つの劣化者とホストコントロールのインキュベーションは、前のセクションで述べた条件で行われました。 TCPの有無にかかわらず5時間インキュベーション後に回収されたサンプルは、ヨウ化プロピジウム（PI）、6-カルボキシ-2’、7′-ジクロロジヒドロフルオレセイン二酢酸（カルボキシ-H2DCFDA）、またはビス-（1,3-ジブチルバルビツール酸）トリメチンオキソノールで染色された。 膜が損なわれた細胞にのみ入るPIなどの核酸の標識用色素は、脂質含有細胞内成分に結合するDibac4（3）などの膜電位感受性色素とともに一般的に使 カルボキシ-H2DCFDAは、真核細胞および原核細胞における活性酸素種（ROS）の存在のための一般的な指標として多くの用途を発見したフルオレセインの化学的に減少し、アセチル化され、カルボキシル化された形態である。 塩素化脂肪族炭化水素の細菌利用に関する最近の研究は、このプロセスが強い酸化ストレスと関連していることを示唆し、我々はTCPもそのような生理 ハロゲン化または脂質過酸化による不飽和脂肪酸の飽和は、膜流動性の変化を引き起こし、電子輸送鎖の崩壊および酸素への早期の電子移動をもたらし、ROSの形成、膜透過性、および細胞死を伴う。

我々の研究で採用されたエンドポイントフローサイトメトリプロトコルは、プラスミドによる負担を実証する上でめっきよりも感度が低かった（図。 2b)、おそらく異種DNAの存在と選択マーカーの構成的発現は、直接サイトメトリーによって標的とされるプロパティを変更するのではなく、細胞の全体的なエ しかし，選択した蛍光色素を用いたフローサイトメトリー法は，ＩＰＴＧとＴＣＰの毒性作用を暴露するのに有用であった。 有意差はなかった（P>0。これらの実験で調べた３つの変数（膜透過性、ＲＯＳ形成、および膜電位；図１ ０を参照）のいずれかに関して、それらのＴＣＰ曝露状態にかかわらず、空のプラスミドを 2b）。 しかし、Dibac4（3）の陽性染色細胞の割合は、IPTG単独で処理されたコントロールで三倍まで増加した（P<0.01）。 同様の効果がdeg31でも観察され、TCPによる誘導およびインキュベーションに対する応答がより詳細に研究された（図10）。 3). ＩＰＴＧによる前処理をＴＣＰ曝露と組み合わせたときに、３つの染料すべてで陽性に染色された細菌集団の画分が何倍も増加し、以前に観察された増悪効果を確 2b、3）。 膜脱分極，ROＳ蓄積，および膜透過性は，合成生分解経路を発現する大腸菌組換え体において減少し，減少の程度はｔｃｐ変換の株の初期速度に比例した。 興味深いことに、IPTGによるBL21(DE3)ホストコントロールの事前誘導による化合物毒性の悪化は、モデル毒性化合物tert-ブチルヒドロペルオキシド(TBHP)、有機過酸化物および強いROS形成促進酸化剤を用いた実験でも確認された（追加ファイル1：図。 S3）。 このことは、記述された悪化現象は、我々のモデル毒性化学物質TCPにのみ限定されるべきではないことを示唆している。

生体内での膜脱分極とROＳ形成は動的プロセスである。 大腸菌分解剤におけるそれらの速度論に従うために、我々はまた、時間分解測定を行った（追加ファイル１：図１ ０Ａ）。 S4）。 Dibac4(3)とカルボキシH2DCFDAによって染色された細胞の数は、deg31を除くストレス組換え体のすべてで時間の経過とともに直線的に増加した。 興味深いことに、このデグレイダーはDibac4（3）とカルボキシH2DCFDA蛍光の初期バーストを示したが、これらの信号は、その後平坦またはわずかに落ちた。 我々は、dibac4（3）とdeg31のカルボキシ-H2DCFDA蛍光の特性プロファイルは、合成生分解経路とTCP生体変換の対応する時間経過のそのユニークな変異体にリンクされていることを前提としています。 他の株とは対照的に、TCP、2,3-ジクロロプロパン-1-オール（DCP）とグリシドール（GDL）は、測定期間の分50と100の間のdeg31反応混合物中に比較的高濃度で存在していた。 これは相乗的毒性を引き起こし、脱分極した膜を有する細胞の数を増加させ、ROS形成を増強した可能性がある。 そのような共同効果は共通です;それらは他の中の有機リン酸塩の殺虫剤、fluorosurfactantsおよび重金属のために、観察されました。 シグナルの強度のその後の凍結または中等度の低下は，ＴＣＰおよびＧＤＬの並行除去およびグリセロールの産生に起因した。

deg31に存在する合成経路の変異体は、TCPを無害なグリセロールに効率的に変換しながら毒性に対処するという点で最良の妥協点を提供するように見えたため、さらなる調査のために選択された。

電子顕微鏡による代謝負荷および基質毒性効果の評価

代謝負荷および毒性は、細菌宿主の形態の変化を引き起こす可能性がある。 したがって、我々は、2mM TCPの有無にかかわらず5時間インキュベーション後の誘導および非誘導deg31細胞の形態の変化を研究するために透過型電子顕微鏡 3). 空のプラスミドを有する誘導および非誘導Ｅ．ｃｏｌｉ宿主対照細胞の写真を（追加ファイル１：図１）に示す。 S5）。 顕微鏡観察は、PI、カルボキシH2DCFDA、またはDibac4（3）で染色deg31細胞のマルチパラメータフローサイトメトリーが続いていた。

非誘導性デグレイダーをTCPでインキュベーションすると、死んだ細菌細胞のわずかな割合しか産生されず、このように処理された細胞の形態は、毒性基質に曝されていない細胞の形態と一般的に異ならなかった（図。 3a、b）。 カルボキシH2DCFDAとPIによって染色された細胞の割合は適度に増加したが、膜電位への影響は観察されなかった。 組換えタンパク質を産生する前に誘導された細菌は、目に見える封入体を集中的に形成し、細胞の極で外膜から細胞質膜の頻繁な分離を示した（Fig. 3c）。 細胞溶解物から得られた組換えタンパク質の大部分は可溶性であったので（データは示されていない）、我々は観察された体が活性酵素から成っていた

前誘導とtcpとのインキュベーションの組み合わせは、最も顕著な形態学的変化をもたらし、PI、カルボキシ-H2DCFDA、およびDibac4について陽性に染色する細胞数の実質的な増加を伴っていた(3)(図3)。 3d）。 損傷した細胞質膜と漏れた内容物を有する多数の死細胞または死細胞がはっきりと見えた。 そうであっても、人口のかなりの部分は、5時間の治療期間にわたってIPTGとTCPの複合効果に抵抗した。 これは主に、deg31のバランスのとれた合成経路とtcpのグリセロールへの高速変換によるものでした。 双安定性は一般的な現象であり、毒性耐性および細菌集団における段階的なストレス応答の原因となる多遺伝子形質の発現における騒音に起因す 要約すると、四つの異なる条件下で処理deg31集団の我々の顕微鏡観察は、以前の結果と一致していたし、IPTGによる事前誘導は、TCP毒性を悪化させるという結

プラスミドによる代謝負荷を経験した細胞における毒性増悪効果の上昇

本研究で使用された大腸菌分解者および宿主コントロールの両方が、DuetプラスミドおよびLacIQ/P lacuv5-T7発現系の代謝負荷に対処しなければならないことを考慮し、これらの成分を含まない大腸菌コントロールを以下の実験に含めることにした。 この目的のために、我々は、プラスミドなしの大腸菌ＢＬ２ １（ＤＥ３）およびｌａｃｉｑ／Ｐ ｌａｃｕｖ５−Ｔ７発現系およびｌａｃオペロンの両方を欠いているクローニング株Ｅ．ｃｏｌｉ Ｄ Ｈ５Ａを使 上記のめっきおよびフローサイトメトリプロトコルを採用することにより、我々は、増悪効果が両方の株で適度または完全に存在しないことを見出した（追加のファイル1：図。 S6A、B）。 これは，ＩＰＴＧとＴＣＰからの二重ストレスがＤｕｅｔプラスミドと対応する発現系を運ぶ株にのみ現れることを示唆している。

我々は、研究された組換え体は、プラスミドによって課される代謝負荷とそれに対応する細胞維持に必要な資源の不足のために、IPTGと毒性基質からの二重ストレスを効率的に抑制することができなかったと推測している。 IPTGの化学構造、その輸送または細胞内の存在は、Duetプラスミドを有する大腸菌BL21（DE3）細胞におけるTCP毒性の発現を容易にする生理学的変化を引き起こ

iptg濃度の調整による代謝負荷と毒性増悪の低減

次に、IPTG濃度を最適化することにより、大腸菌組換え体に課される負荷の低減を試みました。 我々は、TCPを低下させる際のシステムの効率を大幅に損なうことなく、フィットネスコストを最小限に抑えることができるインデューサの可能な限り低濃度を探しました。 Deg31細胞は、0.01〜1.00mMの範囲のIPTG濃度で事前誘導され、細胞生存率および経路効率に対する結果として生じる効果を研究した（図10B）。 4;追加ファイル1:図. S7）。

E. 異種経路の非存在下でのＩＰＴＧ曝露によって宿主に課される負担を評価するために、空のｐＥＴＤｕｅｔおよびｐＣＤＦプラスミドを有する大腸菌ＢＬ２ １（ＤＥ３）をめっきのための 4). 前誘導された分解剤および対照の生存率を、２ｍ Ｍ ＴＣＰを有するリン酸緩衝液中での５時間のインキュベーションの前後にチェックし、ＩＰＴＧに曝露されていない 4a、b）。 インキュベーション後の生存細胞の割合は、それぞれの場合において計算された（図１ ０Ａ）。 4c）。 これらの実験は、ＴＣＰの非存在下であっても、ｉｐｔｇ濃度と組換えＥ．ｃｏｌｉの生存率との間に逆相関があることを示した（図３）。 4a）。 Deg31株は、おそらく合成経路をコードする遺伝子を発現する追加の負担のために、コントロールよりもIPTG濃度の増加からより多くの苦しみました。 ＴＣＰ異化ｄｅｇ３ １株は宿主対照よりも悪化した毒性に対してより耐性であったので、その逆はインキュベーションの５時間後にも真であった（図１ ０Ａ）。 4b、c）。 合成経路株は、最高を除いて、すべてのテストされたIPTG濃度で同様の生存率を示した—deg31 1mM IPTGで事前に誘導されたの相対的な生存率は100％であった。 この遠位値は，ｉｐｔｇのような高濃度の誘導時に分解者が経験する集中的なストレスと懸濁液中の生存可能ではあるが培養不可能な細胞の存在によるインキュベーション前の生存細胞数の過小評価によるものであると仮定した。 めっき実験は、細菌集団の一部が、この高濃度のＩＰＴＧで処理した後、しばらくの間、増殖および再生する能力を回復したことを示した（追加ファイル１：図 S8）。

iptgで予め誘導されたdeg31の静止細胞を用いたTCP生体内変換の時間経過を1.00、0.20、0.05、0.025、および0.01mMで行った（追加ファイル1：図。 Ｓ７）および対応する無細胞抽出物の試料を用いたＳＤＳポリアクリルアミドゲルの濃度測定分析（追加ファイル１：図１ ４）。 S9、表S1）は、: (i)経路酵素の相対比と分解プロファイルの形状は、誘導剤濃度とともに実質的に変化しなかったが、(ii)組換え細菌の全可溶性タンパク質中の三つの経路酵素の含有量は55%(1mM IPTG)から32%(0.01mM IPTG)に減少し、経路の出力は70%から46%に減少した。 TCPのかなりの変換はまた、t7プロモーターの漏れおよび経路内の遺伝子の基礎発現のために非誘導細胞で達成された（追加ファイル1：図。 S7）。

図5は、前のセクションで議論された三つのパラメータのバランスをまとめたものです。(i)ホストの生存率、(ii)経路酵素の細胞発現、および(iii)合成生 我々は、合理的な出力を達成するために経路内の遺伝子の十分な発現を可能にする最小限のIPTG濃度は0.025mMであると結論している。Β-ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質、ラムヌロース-1-リン酸アルドラーゼなどの単一の組換えタンパク質について報告されている完全な遺伝子発現を可能にする同様の誘導剤濃度が報告されている。 0.025mMのIPTG濃度は、最初に試験された誘導物質濃度よりも8倍低く、E.coliにおける異種経路の工学を記述する科学文献で報告された値よりも最大40倍低いことに留意されたい。 低量のＩＰＴＧによる誘導は宿主の適応度を改善した。 しかしながら、0.01mMの最低濃度であっても、非誘導deg31に対して30%、および非誘導宿主対照に対して最大50%、大腸菌分解剤の生存率を低下させた(両方の場合、P<0.05;図10)。 4b）。 そこで，ＩＰＴＧを代替インデューサに置き換える範囲を検討した。

ラクトース

ラクトースはlacオペロンの天然誘導物質であり、合成IPTGの安価な代替品として使用することができる。 実験室および産業スケール両方のIPTGと同じ程度にe.coliの組換え蛋白質の表現を引き起こすことを証明しました。 IPTGとは対照的に、ラクトースはβ-ガラクトシダーゼ（lacZによってコードされる）の基質であり、したがって、大腸菌BL21（DE3）を含む無傷のlacオペロンを有する細胞によ したがって、30mMまでのラクトースの濃度は、≧1mM IPTGで達成できるレベルでクローン化された遺伝子の発現を誘導するために一般的に使用される。

我々は、1mM乳糖とdeg31細胞の事前誘導を検討しました。 本発明者らは、この濃度が、十分な分解効率を付与するレベルでＴＣＰ分解経路遺伝子の発現を誘導するのに十分であると仮定した。 この期待は、ＴＣＰ生体内変換の記録された時間経過、および経路酵素がこれらの条件下で細胞の全可溶性タンパク質の４ １％までを占めるという発見によ Ｓ７およびＳ９、およびテーブルＳ１）。 これらの条件下でのTCPのグリセロールへの理論的な変換は63％であった。 これらの値は、0.025または0.05mM IPTGで予め誘導されたdeg31細胞について観察された値に近い。 最も重要なことは、乳糖で予め誘導されたｄｅｇ３ １細胞は、試験された濃度のいずれかでＩＰＴＧで処理された細菌と比較して、ＴＣＰで５時間インキュベーションの前後 4). 宿主対照に対しても同様の緩和効果が観察された。 生存の観点から、ラクトースで予め誘導された細胞は、それらの非誘導の対応物と同様に、ほぼ同様に行われた（図１ ０Ａ）。 4c）。 めっき結果に合わせて、乳糖で事前誘導された宿主対照およびdeg31細胞のフローサイトメトリー分析は、IPTGで事前誘導された大腸菌株に対して観察されたよりも脱分極膜を有するストレス細胞の有意に低いレベルを明らかにした（P<0.01;追加ファイル1：図。 S10）。 これらの結果は，研究した組換え体におけるＩＰＴＧの作用が一貫して膜特性の変化を伴うことを再び示した。

IPTGの代わりにラクトースで誘導された細胞のより高い生存率は、単一の異種タンパク質の発現について以前に報告されていた。 この効果は，自然誘導剤で達成された遅延した軽度の誘導に起因する。 受動的拡散とレース性ラクトースペルミアーゼの助けを借りて急速に細胞に入ることができる合成IPTGとは対照的に、ラクトースはペルミアーゼを介してのみ細胞質に入ることができる。 さらに、ラクトースはlacリプレッサーに結合する前にβ-ガラクトシダーゼによってアロラクトースに変換されなければならないのに対し、IPTGはリプレッサーに直接結合する。 我々の結果は、ラクトースは、それはまた、大腸菌BL21（DE3）における全体の異種経路の発現のためのより適切な誘導剤であることを示唆し、IPTGよりも低い代謝 これは、毒性化合物を分解するか、または毒性中間体を産生する合成経路を有する大腸菌BL21（DE3）細胞にとって特に重要である。