1はじめに
膜貫通タンパク質(Tmp)の遺伝子は、ほとんどのゲノムの20〜30%を占めており(Wallin&Heijne,1998)、細胞生理学における重要な役割に基づいて、tmpは臨床的に有用な薬物の大部分の標的である。 したがって、それらの構造および作用様式の決定はかなり重要である。 しかし、利用可能な高解像度のTMP構造の数は比較的少ないままである（Stephen WhiteのWebページ;http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/を参照）。 X線回折研究に用いられるTmpの良好な回折結晶を得ることが困難であるために頻繁に呼び出される2つの説明は、(1)Tmpは構造的に動的であり、タンパク質が結晶へのパッキングに必要な均一な立体配座を採用することを困難にする柔軟な領域であること、および(2)tmpの膜貫通領域の表面は、結晶パッキングに必要なタンパク質-タンパク質相互作用において球状可溶性タンパク質の表面ほど容易に関与しないことである。 TMPの表面に露出した領域に安定した可溶性タンパク質を導入することは、TMP内の内部位置でのこのような挿入は、全体的な柔軟性を低下させることができ、容易に結晶化可能な可溶性ドメインの存在は、結晶化に必要な分子間接触を提供することができるので、潜在的にこれらの問題の両方を回避する方法を提供する（Chun et al. 2012;Engel,Chen,&Privé,2002)。
TMPsの内部位置でのT4リゾチーム（T4L）の融合は、これまでに、重要なGPCRスーパーファミリーの多様なメンバーの構造の決定のための成功したアプローチを提 ら，２ ０ ０ ７；Ｃｈｉｅｎ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、２ ０ １ ０；Ｄｏｒｅ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、２ ０ １ ４；Ｆｅｎａｌｔｉ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、２ ０ １ ４；Ｇｒａｎｉｅｒ ｅ ｔ ａ ｌ． ら，２ ０ １ ２；Ｈａｇａら，２ ０ １ ２；Ｈａｇａら， ら、２ ０ １ ２；Ｈａｎｓｏｎ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、２ ０ １ ２；Ｈｏｌｌｅｎｓｔｅｉｎ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、２ ０ １ ３；Ｊａａｋｏｌａ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、２ ０ ０ ８；Ｋｒｕｓｅ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、２ ０ １ ２；Ｍａｎｇｌｉｋ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、２ ０ １ ２；Ｒｏｓｅｎｂａｕｍ ｅ ｔ ａ ｌ． ら，２ ０ ０ ７，２ ０ １ １；Ｓｈｉｍａｍｕｒａ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、２ ０ １ １；Ｔａｎ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、２ ０ １ ３；Ｗａｃｋｅｒ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、２ ０ １ ３；Ｗａｎｇ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、２ ０ １ ３；Ｗｈｉｔｅ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、２ ０ １ ２；Ｗｕ ｅ ｔ ａ ｌ．, 2010, 2012; Xu et al. ら、２ ０ １ １；Ｚｈａｎｇ ｅ ｔ ａ ｌ．, 2012). 熱的に安定化されたアポサイトクロムｂの同様の内部融合物（Ｗａｃｋｅｒ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、２ ０ １ ３；Ｗａｎｇ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、２ ０ １ ３；Ｚｈａｎｇ，Ｚｈａｎｇ，Ｇａｏ，Ｐａｏｌｅｔｔａ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、２ ０ １ ４；Ｚｈａｎｇ，Ｚｈａｎｇ，Ｇａｏ，Ｚｈａｎｇ，ｅｔ ａ ｌ． ら、２ ０ １ ４）およびｒｕｂｒｅｄｏｘｉｎ（Ｔａｎ ｅ ｔ ａ ｌ． ら，２ ０ １ ３）もＧＰＣＲ構造を得た。 さらに、いくつかのＧＰＣＲ構造は、内部位置ではなく、安定化タンパク質パートナーが受容体配列のＮ末端で融合された構築物の結晶化によって得られた（Ｆｅｎａｌｔｉ ｅ ｔ ａ ｌ． ら，２ ０ １ ４；Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ，Ｃｈｏｉ，ｅｔ ａ ｌ． ら，２ ０ １ １；Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ，Ｄｅｖｒｅｅ，ｅｔ ａ ｌ． 2011年泌et al. ら、２ ０ １ ３；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、２ ０ １ ２；Ｗｕ ｅ ｔ ａ ｌ．,2014),分子間接触の形成の促進における融合タンパク質の役割は、TMP柔軟性の低下よりも結晶化を促進するために重要であり得ることを示唆している. 融合タンパク質の使用を伴わないＧＰＣＲ構造を得るための代替的手法には、抗受容体抗体との共結晶化が含まれている（Ｋｒｕｓｅ ｅ ｔ ａ ｌ． ら，２ ０ １ ３；Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ，Ｃｈｏｉ，ｅｔ ａ ｌ． ら、２ ０ １ １；Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ ｅ ｔ ａ ｌ． ら，２ ０ ０ ７；Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ，Ｄｅｖｒｅｅ，ｅｔ ａ ｌ． ら，２ ０ １ １；Ｒｉｎｇ ｅ ｔ ａ ｌ． 点突然変異および欠失の導入によって恒温安定化されたＧＰＣＲ変異体の結晶化（Ｅｇｌｏｆｆ ｅ ｔ ａ ｌ．，２ ０ １ ３）およびｇｐｃｒ変異体の結晶化（ｅｇｌｏｆｆ ｅ ｔ ａ ｌ．，２ ０ １ ３）を参照のこと。 ることを可能にすることを目的としています。 実際には、成功した構造決定のために使用されるほとんどの融合タンパク質含有GPCR変異体は、さらにタンパク質の安定性を高め、柔軟性を低下させる
結晶化を促進する目的でのTmpへの安定可溶性タンパク質の挿入は、一般に、Gpcrの第3の細胞内（IC3）ループ内の残基の挿入または置換として行われ これは、受容体中のこの領域が柔軟であり、周囲のヘリックスの相対運動を制御し得るという期待に基づいている（Rosenbaum et al. ら、２ ０ ０ ７）、ならびに融合パートナーの挿入が全体的なＧＰＣＲ構造を破壊する可能性を低減する（Ｃｈｕｎ ｅ ｔ ａ ｌ．，２ ０ ０ ７）。, 2012). このような挿入は、しばしば受容体の全体的な構造を破壊しないが（融合構築物による少なくともいくつかのリガンド結合親和性の保持に基づいて）、 これは、IC3ループがGpcrとその即時下流エフェクターである三量体Gタンパク質との間の機能的相互作用の部位であることが多いため、驚くべきことで さらに、融合タンパク質の挿入のための特定の接合部位を確立するための基準、およびそれらが置換する受容体配列の量を決定するための基準は、 成功した融合は、挿入されたタンパク質のＮ−およびＣ−末端の間隔および配向とＧＰＣＲ中の接合部位との間の最適な一致を提供しなければならない（Ｃｈｕｎ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、２ ０ １ ２；Ｅｎｇｅｌ ｅ ｔ ａ ｌ．, 2002). したがって、有用な融合の作成は、融合遺伝子の複数のバージョンの合成または構築を必要とし得る（Ｒｏｓｅｎｂａｕｍ ｅ ｔ ａ ｌ．, 2007).
ここでは、ループ配列内のアミノ酸残基の異なる数の置換として、第三の細胞内（IC3）ループ内の異なる点でT4Lの挿入を含む受容体の変異形のライ 酵母で受容体を発現することにより、リゾチーム挿入と変異体のランダム化ライブラリを作成し、直接最大の全体的な発現レベル、細胞表面でのリガンド結合部位の数、さらには受容体機能を持つコンストラクトをスクリーニングすることが可能であり、同族Gタンパク質の活性化に基づいてアッセイすることができる。 このアプローチは、ほぼ完全なシグナル伝達機能を保持するIC3ループ内の挿入を有する受容体を同定することに成功した。 これは、適切な連結配列を介して結合された場合、活性化された受容体の関連する表面へのＧタンパク質のアクセスを妨げることなく、Ｔ４Ｌ分子
記載されたプロトコルは、三次元構造がまだ利用できない扱いやすい初期システムとして使用される酵母Saccharomyces cerevisiaeの内因性GPCRであるSte2Pを用いて開発された。 しかしながら、酵母フェロモン応答経路を活性化することができると報告されている多数の哺乳動物Ｇｐｃｒの挿入含有変異体を同定するために、同様の Ｄｏｗｅｌｌ＜８ ５ ８ ６＞Ｂｒｏｗｎ，２ ０ ０ ９；Ｋｉｎｇ，Ｄｏｈｌｍａｎ，Ｔｈｏｒｎｅｒ，Ｃａｒｏｎ，＜８ ５ ８ ６＞Ｌｅｆｋｏｗｉｔｚ，１ ９ ９ ０；Ｐａｕｓｃｈ，１ ９ ９ ７）、または無傷の細胞における機能についてアッセイすることが可能な他のＴｍｐに適用することができる。 さらに、酵母種は、Ｇｐｃｒおよび他のＴｍｐの構造決定のための発現系として使用されている（Ｃｌａｒｋ ｅ ｔ ａ ｌ．、2010）、ヒトH1ヒスタミン受容体の結晶構造の決定のためのものを含む（Shimamura et al. ら，２ ０ １ １；Ｓｈｉｒｉｓｈｉ ｅ ｔ ａ ｌ．, 2011). Ste2pは、13残基ペプチドである酵母交配フェロモンα因子の受容体である。 このリガンドの結合は、細胞質ヘテロ三量体Gタンパク質の活性化をもたらし、MAPキナーゼ経路を活性化し、最終的に転写応答、細胞形状の変化、細胞周期の停止、反対の交配型の酵母細胞との融合をもたらす。