1 소개
막 횡단 단백질의 유전자는 대부분의 게놈의 20-30%를 차지하며(월린&하이네,1998),세포 생리학에서 중요한 역할을 기반으로,막 횡단 단백질은 임상 적으로 유용한 약물의 많은 부분의 표적입니다. 따라서,그들의 구조 및 행동 방식의 결정은 상당한 중요성을 갖는다. 그러나 사용 가능한 고해상도 티엠엠 구조의 수는 상대적으로 낮습니다(스티븐 화이트의 웹 페이지 참조;http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/). 엑스선 회절 연구에 사용하기 위해 잘-회절성 결정체를 얻는 데 어려움을 겪는 두 가지 설명은(1)회절성 결정체는 단백질이 결정으로 패킹하는 데 필요한 균일 한 형태를 채택하기 어렵게 만드는 유연한 영역과 구조적으로 동적이며,(2)회절성 결정체의 막 횡단 영역의 표면은 결정 패킹에 필요한 단백질-단백질 상호 작용에서 구형 가용성 단백질의 표면만큼 쉽게 참여하지 않습니다. 안정한 용해성 단백질을 표면 노출 영역에 도입하는 것은 잠재적으로 이러한 문제를 모두 우회하는 방법을 제공하는데,이는 내부 위치에 이러한 삽입이 전반적인 유연성을 감소시킬 수 있고 쉽게 결정화 가능한 용해성 도메인의 존재가 결정화에 필요한 분자간 접촉을 제공 할 수 있기 때문이다. 2012 년;Engel,첸,&Privé,2002).1107>
1107 의 내부 위치에서 라이소자임(라이소자임)의 융합은,현재까지,중요 한 슈퍼패밀리(체레조프 외)의 다양 한 구성원의 구조 결정에 대 한 성공적인 접근을 제공 했다. 2007;치엔 등. 2010;도레 등. 2014;페날티 외.,2014;그라니에 외. 2012;하가 등.,2012;핸슨 외. 2012;홀렌슈타인 외. 2013;자콜라 외. 2008;크루세 외. 2012;만글릭 외. 2012;로젠바움 외. 2007,2011;시마무라 외.,2011;탄 등. 2013;바커 외.,2013;왕 등.,2013;화이트 외.,2012;우 외., 2010, 2012; 쑤 등.,2011;장 외., 2012). 열적으로 안정화 된 아포 키토 크롬의 유사한 내부 융합 비(바커 외.,2013;왕 등.,2013;장,장,가오,파올레타 등.,2014;장,장,가오,장,등. 2014)및 루브레독신(탄 외). 2013)는 또한 다음과 같은 구조를 산출했습니다. 또한,여러 가지 단백질 파트너 안정화 단백질 파트너 수용 체 시퀀스의 엔-말단 보다는 내부 위치(페 날 티 외.)에서 융합 된 구조의 결정 화에 의해 얻어졌다. 2014;라스무센,최,외. 2011;라스무센,데브리,등. 2011;시우 등. 2013;톰슨 외.,2012;우 외. 2014),분자 간 접촉의 형성의 촉진에 융합 단백질의 역할 보다 결정 화 촉진에 대 한 더 중요 한 수 있습니다 제안. 핵융합 단백질의 사용을 포함하지 않는 핵융합 핵융합 구조를 얻기위한 대안적인 접근법에는 항 수용체 항체(크루 제 외.2)와 함께 동결정이 포함되어있다. 2013;라스무센,최,외. 2011;라스무센 외. 2007;라스무센,데브리,등.,2011;링 등. 2013)및 점 돌연변이 및 삭제의 도입에 의해 온도 안정 화 된 점 변이체의 결정화(에글 로프 외.2013)및 점 돌연변이 및 삭제의 도입에 의해 온도 안정 화 된 점 변이체의 결정화. 2014;스콧,쿠머,트렘멜,&플럭 툰,2013;테이트,2012). 사실,성공적인 구조 결정에 사용 된 대부분의 융합 단백질 함유 단백질 변이체는 또한 단백질 안정성을 더욱 향상시키고 유연성을 감소 시키도록 설계된 점 돌연변이 및 절단을 통합했습니다.
결정화를 촉진시키기 위한 목적으로 안정한 용해성 단백질의 삽입은 일반적으로 제 3 세포내 루프의 잔기에 대한 삽입 또는 대체로서 수행되어 왔다. 이것은 수용체에서이 영역이 유연하고 주변 나선의 상대 운동을 제어 할 수 있다는 기대에 기초(로젠 바움 등. 2007 년)뿐만 아니라,가능성을 감소시키는 삽입의 융합 협동자를 중단합니다 전반적인 GPCR 구조(천 et al., 2012). 이러한 삽입은 종종 수용체의 전체 구조를 방해하지 않지만(융합 구조에 의한 적어도 일부 리간드 결합 친화도의 유지에 기초),이들은 일반적으로 동족 삼량체 단백질을 활성화시키는 능력의 손실을 초래한다(로젠바움 외. 이 두 가지 주요 기능은 다음과 같습니다. 또한,융합 단백질의 삽입에 대 한 특정 접합 사이트를 설정 하 고 그들이 대체 하는 수용 체 시퀀스의 양을 결정 하기 위한 기준은 잘 설립 되지 않습니다. 성공적인 융합 간격 및 방향 사이 최적의 일치를 제공 해야 합니다. 2012;엥겔 외., 2002). 따라서,유용한 융합의 생성은 융합 된 유전자의 여러 버전의 합성 또는 구성을 요구할 수있다(로젠 바움 외., 2007).
우리는 여기 생성 하 고 세 번째 세포내(아이 3)루프에서 다른 지점에서 아미노산 잔기의 다른 번호에 대 한 대체(매튜,딩,나이더,&뒤 몽,2013)의 삽입을 포함 하는 수용 체의 변형 형태의 라이브러리를 스크리닝에 대 한 전략을 설명 합니다. 효모에 있는 수용체를 표현해서,리소자임 삽입을 가진 이체의 무작위화한 도서관을 창조하고 직접 극대 전반적인 표정 수준,세포 표면에 리간드 바인딩 위치의 수 및 동족 지 단백질의 활성화에 근거를 둔 분석된 수용체 기능 조차 가진 구조를 위해 가리는 것이 가능합니다. 접근 거의 전체 신호 기능을 유지 하는 3 루프에 삽입 하는 수용 체 식별에 성공 했다. 이 제안,적절 한 연결 시퀀스를 통해 연결 하는 경우 티 4 엘 분자 활성화 수용 체의 관련 표면에 지 단백질의 액세스를 방지 하지 않고이 루프에 삽입 될 수 있습니다.
설명 된 프로토콜은 3 차원 구조를 아직 사용할 수 없는 다루기 쉬운 초기 시스템으로 사용 되는 효 모 사 카로 마이 세스 세레비시에의 내생 적자 분자를 사용 하 여 개발 되었다. 그러나,유사한 접근 효 모 페로몬 응답 경로 활성화 할 수 있을 것 이라고 보고 되었습니다 수많은 포유류 유전자 발육종의 삽입 포함 된 변종을 식별 하는 데 사용할 수 있습니다. 또한,본 발명의 실시예에 따르면,본 발명의 실시예에 따르면,본 발명의 실시예에 따라,본 발명의 실시예에 따라,본 발명의 실시예에 따라,본 발명의 실시예에 따라,본 발명의 실시예에 따른 실시예에 따라,본 발명의 실시예에 따른 실시예에 따른 실시예에 따른 실시예에 따른 실시예에 따른 실시예에 따른 실시예에 따른 실시예에 따른 실시예에 따른 실시예에 따른 실시예에 따른 실시예에 따른 실시예에 따른 실시예에 따른 실시예에 따른 실시예에 따른 실시예에 따른 실시예에 따른 실시예에 따른 실시예에 따른 실시예에 따른 실시예에 따른 실시예에 따른 실시예에 따른 실시예에 따른 실시예에 따른 또한,효모종은 지피피놀과 다른 지피피놀의 구조측정을 위한 발현 시스템으로서 사용되어왔다. 히스타민 수용체(시마무라 등)의 결정 구조 결정을위한 것을 포함한다. 2011;시로이시 외., 2011). Ste2p 수용체 위해 효모 결 페로몬 α-factor,13 잔류물 펩티드. 이 리간드의 결합은 세포질 이종 삼중 체 단백질의 활성화를 초래하며,이는 차례로 지도 키나아제 경로를 활성화시켜 궁극적으로 전사 반응,세포 모양의 변화,세포주기 체포 및 반대 짝짓기 유형의 효모 세포와의 융합으로 이어집니다.