Forverring av substrattoksisitet Ved Iptg I Escherichia coli BL21(DE3) som bærer en syntetisk metabolismevei

Biotransformasjon av TCP ved å hvile E. coli BL21(DE3) celler som bærer varianter av en syntetisk nedbrytningsvei

Varianter av den syntetiske banen med enten villtype haloalkane DEHALOGENASE Eller DEN 26 GANGER KATALYTISK MER EFFEKTIVE mutanten dhaa31 Ble Introdusert I E. Coli Bl21(de3) . Denne verten ble valgt fordi verken enzymer eller metabolitter av TCP-banen forekommer naturlig i sitt metabolske nettverk og på grunn av det brede repertoaret av kommersielt tilgjengelige duettvektorer for denne stammen, som muliggjør tunbar koekspresjon av flere gener i en enkelt celle . Dette resulterte i bygging av et fleksibelt system med begrenset risiko for metabolsk kryssprat, hvor uttrykket av de tre banekomponentene kunne manipuleres ortogonalt . Tre tidligere bygget E. coli BL21 (DE3) degraderer betegnet degWT, deg31 og deg31opt ble testet (Tabell 1). E. coli degwt bærer en variant AV TCP-banen basert på villtype DhaA sammen med HheC og EchA, uttrykt i et relativt forhold på henholdsvis 0,24:0,36:0,40, som bestemt etter pre-induksjon med 0,2 mM Iptg (Tilleggsfil 1: Fig . S1). Stammer deg31 og deg31opt bærer BEGGE TCP-banen med den konstruerte dehalogenasen DhaA31, men det relative forholdet mellom de tre enzymene i deg31 er 0,14:0,41:0,45 mens i deg31opt er det 0,63: 0,16: 0,21. Natriumdodecylsulfat polyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) eksperimenter indikerte at de tre veienzymer sammen utgjorde en tilsvarende andel av den totale oppløselige proteinfraksjonen produsert av alle tre nedbrytere: 52% for degWT, 54% for deg31 og 44% for deg31opt.

Pre-indusert (0.2 mM IPTG) hvilende celler av hver av de rekombinante stammene og en vertskontroll (Tabell 1)ble inkubert i fosfatbuffer med 2 mM TCP, og tidsretningene FOR tcp biotransformasjon over et 5 h-intervall ble registrert (Fig. 1). Reaksjonsprofilene viste grunnleggende forskjeller mellom stammene med hensyn til de opprinnelige ratene FOR tcp-dehalogenering, akkumulering av mellomprodukter og total effektivitet av glyseroldannelse. De teoretiske konsentrasjonene av glyserol, ellers raskt utnyttet Av E. coli, kan beregnes ut fra eksperimentelle konsentrasjoner AV TCP og detekterte mellomprodukter i kraft av banens ortogonale natur . Mens deg31opt dratt nytte av den raskeste første skritt(Fig. 1d), den best balanserte banen med den høyeste glyserolproduksjonen var deg31 (Fig. 1c). På den annen side led degWT av langsom tcp-konvertering(Fig. 1b), langvarig eksponering for det giftige substratet og utilstrekkelig veiutgang. Som forventet er vertskontrollen (som bærer de tilsvarende tomme plasmidene, Fig. 1a) viste ingen aktivitet mot TCP i det lukkede batchsystemet.

de tre E. coli rekombinanter og kontrollstammen som mangler syntetisk rute representerer et egnet modellsystem for å studere bidraget av metabolsk byrde og substrat / metabolitt toksisitet til kondisjonskostnaden FOR tcp biotransformasjon av helcellekatalysatorer.

Vurdering av metabolsk byrde og substrattoksisitetseffekter ved plating

cellevibilitet, estimert ved plating, er en viktig fysiologisk parameter som bør gjenspeile de enkelte stammers evne til å takle stressene forårsaket av metabolsk byrde og tcp-eksponering . E. coli degraders pre-indusert med 0.2 mM iptg og vertskontroller ble belagt før og etter 5 h inkubasjon i fosfatbuffer med eller uten 2 mM TCP. Prosentandelen av overlevende celler ble beregnet etter inkubasjon.

dataene fra plating før inkubasjon (Fig . 2a) illustrerer de separate effektene av individuelle elementer av den totale metabolske byrden pålagt cellene. Flere faktorer, inkludert tilstedeværelsen av plasmid-DNA og tilhørende seleksjonsmarkører, tilsetningen av IPTG og byrden på grunn av heterolog baneuttrykk, påvirket nedbryternes levedyktighet parallelt selv før tilsetningen av det giftige substratet. Den mest uttalt innvirkning på dette stadiet skyldtes plasmid vedlikehold og tilhørende konstitutiv ekspresjon av seleksjonsmarkørgener fra Duetvektorer, samt tilstedeværelsen av IPTG. Tilstedeværelsen av to middels til høy kopi plasmider pCDF (20-40 kopier per celle) og pETDuet (~40 kopier per celle) redusert levedyktighet med 50 % (P < 0,01; Fig. 2a). «Pre-induksjon» av vertskontrollen med tomme plasmider reduserte levedyktigheten med nesten 40% i forhold til den ikke-induserte kontrollen (P < 0,01). Ekspresjonen av veienzymer i E. coli-nedbrytingene reduserte levedyktigheten ytterligere med ca. 20% (P < 0,05). Ytterligere reduksjon av levedyktigheten til deg31opt sammenlignet med degWT og deg31 kan potensielt tilskrives forskjellen i seleksjonsmarkører for antibiotika blant tre rekombinanter.

dataene samles inn etter 5 h inkubasjon med ELLER uten TCP (Fig. 2b og Tilleggsfil 1: Fig. S2) inkluderte flere uventede observasjoner. Overraskende nok hadde TCP (opprinnelig tilsatt i en konsentrasjon på 2 mM) bare små eller ubetydelige effekter på levedyktigheten til ikke-induserte kontrollceller som bærer tomme plasmider; det var ingen signifikant forskjell i levedyktighet mellom disse cellene og vertskontrollene som ble utsatt for VERKEN TCP eller IPTG. DETTE var uventet fordi TCP har blitt rapportert å sterkt hemme voksende celler Av E. coli BL21 (DE3) og naturlige verter som a. radiobacter AD1 ELLER Pseudomonas putida MC4 selv ved konsentrasjoner 50% lavere enn de som brukes her . På DEN annen side var den skadelige effekten av IPTG statistisk signifikant (P < 0,01) (Fig. 2b og Tilleggsfil 1: Fig. S2). Den mest slående observasjonen var at den relative levedyktigheten til celler pre-indusert MED IPTG og deretter utsatt FOR TCP var nesten 90% lavere enn for vertskontroller utsatt for verken substans (P < 0,01) (Fig. 2b). Dette dramatiske tapet av levedyktighet samsvarer ikke med en enkel sum av de to forbindelsenes individuelle effekter; det er åpenbart AT IPTG forverret toksisiteten TIL TCP. Det faktum AT IPTG forverret giftigheten AV TCP og ikke omvendt ble bekreftet ved plating av tre rekombinanter som bærer den syntetiske bionedbrytningsveien (Fig. 2b). Fordi disse degraderne hadde funksjonelle veier FOR TCP-nedbrytning, var de bedre i stand til å tolerere sin tilstedeværelse. Viktigere, jo raskere konvertering AV TCP av vei enzymer, jo større degraders levedyktighet. Deg31opt, som oppnådde en rask innledende konvertering AV TCP, men akkumulerte betydelige mengder av mellomproduktene DCP og GDL, overlevde 5 h inkubasjonen nesten så vel som vertskontrollen som ikke ble utsatt for substratet. Disse dataene er i samsvar med de tidligere rapporterte resultatene av vekst arrest tester, som indikerte AT TCP er den mest giftige forbindelsen i veien .

Vurdering av metabolsk byrde og substrat toksisitet effekter av multi-parameter flowcytometri

Multi-parameter flowcytometri tillater samtidig bestemmelse av flere biokjemiske og fysiske variabler umiddelbart etter prøvepreparering og bør derfor gi mer nøyaktig informasjon om cellenes fysiologiske status enn det som kan oppnås ved plating . Denne teknikken gir også nøkkelinformasjon om heterogeniteten til bakteriepopulasjoner. I motsetning til plating undervurderer det ikke antall levedyktige celler i originale kulturer i tilfeller der en brøkdel av befolkningen har opplevd sublethal skade og mistet evnen til å vokse .

Inkubasjon av de tre degraders og vertskontroller ble utført under betingelsene nevnt i forrige avsnitt. Prøvene som ble trukket tilbake etter 5 timers inkubasjon med ELLER uten TCP ble farget med propidiumjodid (PI), 6-karboksy-2′,7′-diklordihydrofluoresceindiacetat(karboksy-H2DCFDA) eller bis-(1,3-dibutylbarbitursyre) trimetinoksonol . Fargestoffer for merking av nukleinsyrer, SOM PI, som bare går inn i celler med kompromitterte membraner, brukes ofte med membranpotensialfølsomme fargestoffer Som DiBAC4(3), som binder de lipidholdige intracellulære komponentene, for å studere bakteriell levedyktighet . Carboxy-H2DCFDA er en kjemisk redusert, acetylert og karboksylert form av fluorescein som har funnet mange anvendelser som en generell indikator for tilstedeværelsen av reaktive oksygenarter (ROS) i eukaryote og prokaryote celler . Nylige studier på bakteriell utnyttelse av klorerte alifatiske hydrokarboner tyder på at denne prosessen er forbundet med sterkt oksidativt stress, og vi antok at TCP også ville fremkalle en slik fysiologisk respons . Metningen av umettede fettsyrer ved halogenering eller lipidperoksydasjon forårsaker endringer i membranfluiditet, noe som resulterer i sammenbrudd av elektrontransportkjeder og for tidlig elektronoverføring til oksygen, ledsaget av ROS-dannelse, membranpermeabilisering og celledød .

end-point flow cytometry protokollen vedtatt i vår studie var mindre følsom enn plating i å demonstrere byrden forårsaket av plasmider (Fig. 2b), muligens fordi tilstedeværelsen av heterologt DNA og det konstitutive uttrykket av seleksjonsmarkører ikke direkte endret egenskaper målrettet av cytometri, men i stedet ubalanserte cellens samlede energistatus. Flowcytometri-tilnærmingen ved bruk av utvalgte fluorokromer var imidlertid nyttig for å eksponere toksiske effekter av IPTG og TCP. Det var ingen signifikante forskjeller (P > 0.05) mellom de ikke-induserte vertskontrollene med tomme plasmider, uavhengig av DERES tcp-eksponeringsstatus, med hensyn til noen av de tre variablene som ble undersøkt i disse forsøkene (membranpermeabilitet, ROS-dannelse og membranpotensial; se Fig. 2b). Andelen celler som farget positivt For DiBAC4(3) økte imidlertid opp til tredoblet i kontrollen behandlet med IPTG alene (P < 0,01). Den samme effekten ble også observert i deg31, hvis respons på induksjon og inkubasjon med TCP ble studert mer detaljert (Fig. 3). Fraksjonen av bakteriepopulasjonen som farger positivt med alle tre fargestoffer økte mange ganger når forbehandling med IPTG ble kombinert MED TCP-eksponering, bekrefter den tidligere observerte forverrende effekten og indikerer at VIRKNINGEN AV TCP i bakterieceller er ledsaget av omfattende ROS-dannelse (Fig. 2b, 3). Membrandepolarisering, ros-akkumulering og membranpermeabilitet ble redusert i e. coli-rekombinanter som uttrykte den syntetiske bionedbrytningsveien, med graden av reduksjon som proporsjonal med stammenes innledende frekvenser AV TCP-konvertering. Interessant, forverring av sammensatte toksisitet ved pre-induksjon AV BL21(DE3) vert kontroll MED IPTG ble bekreftet også i eksperimenter ved hjelp av modellen giftig forbindelse tert-butyl hydroperoxide( Tbhp), en organisk peroxide og sterk ROS dannelse fremme oksidativt middel (Ekstra fil 1: Fig. S3). Dette antyder at beskrevet eksacerbasjon fenomen ikke bør begrenses bare til vår modell giftig kjemisk TCP.

Membrandepolarisering og ROS-dannelse in vivo er dynamiske prosesser. For å følge deres kinetikk I E. coli degraders utførte vi også tidsoppløste målinger (Tilleggsfil 1: Fig. S4). Antallet celler farget Av DiBAC4(3)og karboksy-H2DCFDA økte lineært over tid i alle de stressede rekombinantene unntatt deg31. Interessant nok viste denne nedbryteren en første utbrudd Av DiBAC4(3) og carboxy-H2DCFDA fluorescens, men disse signalene plateaued eller falt litt. Vi antar at de karakteristiske profilene Til DiBAC4(3) og carboxy-H2DCFDA fluorescens for deg31 er knyttet til sin unike variant av den syntetiske bionedbrytningsveien og den tilsvarende tidskursen FOR TCP biotransformasjon. I motsetning til de andre stammene var TCP, 2,3-dikloropropan-1-ol (DCP) og glycidol (GDL) tilstede ved relativt høye konsentrasjoner i deg31-reaksjonsblandingen mellom minutter 50 og 100 i måleperioden. Dette kan ha forårsaket synergistisk toksisitet, øke antall celler med depolariserte membraner og forbedret ROS-dannelse. Slike felles effekter er vanlige; de har blitt observert for blant annet organofosfatpesticider, fluorosurfaktanter og tungmetaller . Etterfølgende frysing eller moderat fall i intensiteten av signalene ble tilskrevet parallell fjerning AV TCP og GDL og produksjon av glyserol, som er kjent for å være et effektivt stressbeskyttende middel i gjær og løsemiddeltolerante stammer Av E. coli .

varianten av den syntetiske banen som er tilstede i deg31 syntes å gi det beste kompromisset når det gjelder å takle toksisitet mens DEN effektivt konverterte TCP til ufarlig glyserol og ble derfor valgt for videre undersøkelse.

Vurdering av metabolisk byrde og substrattoksisitetseffekter ved elektronmikroskopi

Metabolsk byrde og toksisitet kan forårsake endringer i morfologien til bakterielle verter . Vi brukte derfor transmisjonselektronmikroskopi for å studere endringene i morfologi av induserte og ikke-induserte deg31-celler etter 5 h inkubasjon med eller uten 2 mM TCP (Fig . 3). Bilder av induserte Og ikke-induserte e. coli vertskontrollceller med tomme plasmider er vist i (Tilleggsfil 1: Fig. S5). Mikroskopiske observasjoner ble fulgt av flyparameter flowcytometri av deg31-celler farget MED PI, karboksy-H2DCFDA eller DiBAC4(3).

Inkubasjon av ikke-induserte nedbrytere med TCP produserte bare en liten andel døde bakterieceller, og morfologien til celler behandlet på denne måten var generelt ikke forskjellig fra cellene som ikke var eksponert for det giftige substratet (Fig. 3a, b). Andelen celler farget av karboksy-H2DCFDA og PI økte moderat, men ingen effekt på membranpotensialet ble observert. Pre-induserte bakterier som produserer rekombinante proteiner intensivt dannet synlige inkluderingslegemer og viste hyppig separasjon av cytoplasmisk membran fra den ytre membranen ved polene i cellen (Fig. 3c). Siden flertallet av rekombinante proteiner oppnådd fra cellelysater var oppløselige (data ikke vist), tror vi at de observerte legemene besto av aktive enzymer.

kombinasjonen av pre-induksjon og inkubasjon med TCP ga de mest uttalt morfologiske endringene og ble ledsaget av betydelige økninger i antall celler som farger positivt for PI, karboksy-H2DCFDA og DiBAC4(3) (Fig . 3d). Tallrike døde eller døende celler med skadede cytoplasmatiske membraner og lekket innhold var tydelig synlige. Likevel motsto en betydelig del av befolkningen de kombinerte effektene AV IPTG og TCP over 5 h behandlingsperioden. Dette skyldtes hovedsakelig den velbalanserte syntetiske veien til deg31 og den raske omdannelsen AV TCP til glyserol. Bistabilitet er et vanlig fenomen og kan tilskrives støy i uttrykket av de multigene egenskapene som er ansvarlige for toksisitetstoleranse og den graderte stressresponsen i bakteriepopulasjonen . Oppsummert var våre mikroskopiske observasjoner av deg31-populasjoner behandlet under fire forskjellige forhold i samsvar med tidligere resultater og støttet konklusjonen om at pre-induksjon med IPTG forverrer TCP-toksisitet.

Toksisitetsforverrings-effekten stiger i celler som opplever metabolsk byrde fra plasmider

Gitt at Både E. coli-nedbrytere og vertskontrollene som ble brukt i dette arbeidet, måtte takle den metabolske byrden Av Duet-plasmidene og LacIQ / P lacUV5-T7 expression-systemet, bestemte vi Oss for å inkludere E. coli-kontroller uten disse komponentene i følgende eksperiment. Til dette formål brukte Vi E. coli BL21 (DE3) uten plasmider og klonestammen E. coli DH5a, som mangler Både LacIQ/P lacUV5-T7 expression system og lac operon. Ved å anvende plating-og flowcytometri-protokollene beskrevet ovenfor, fant vi at eksacerbasjonseffekten var beskjeden eller helt fraværende i begge stammer (Tilleggsfil 1: Fig. S6A, B). Dette antyder at dobbeltspenningen fra IPTG og TCP bare manifesteres i stammer som bærer Duet-plasmider og det tilsvarende uttrykkssystemet.

vi antar at de studerte rekombinantene ikke effektivt kunne undertrykke dobbeltspenningen fra IPTG og det giftige substratet på grunn av den metabolske byrden pålagt av plasmider og den tilsvarende mangelen på ressurser som kreves for cellevedlikehold. Det ser ut til at den kjemiske strukturen TIL IPTG, dens transport eller tilstedeværelse inne i cellen utløser fysiologiske endringer som letter manifestasjonen AV TCP-toksisitet I e. coli BL21(DE3) celler med Duet-plasmider.

Redusere metabolsk byrde og toksisitetsforverring ved å justere iptg-konsentrasjonen

Deretter forsøkte vi å redusere byrden pålagt E. coli rekombinanter ved å optimalisere konsentrasjonen av Iptg. Vi så etter lavest mulig konsentrasjon av induktor som ville minimere treningskostnadene uten å kompromittere systemets effektivitet ved å forringe TCP. Deg31-celler ble forhåndsindusert med IPTG-konsentrasjoner fra 0,01 til 1,00 mM, og de resulterende effektene på celleviabilitet og virkningsgrad ble studert (Fig. 4; Tilleggsfil 1: Fig. S7).

E. coli BL21 (DE3) med de tomme pETDuet-og pCDF-plasmidene ble brukt som en kontroll for plating for å vurdere byrden pålagt verten ved IPTG-eksponering i fravær av den heterologe banen (Fig. 4). Levedyktigheten til den pre-induserte degraderen og kontrollen ble kontrollert før og etter 5 h inkubasjon i fosfatbuffer med 2 mM TCP og sammenlignet med celler som ikke ble utsatt for IPTG (Fig. 4a, b). Prosentandelen av overlevende celler etter inkubasjon ble beregnet i hvert tilfelle(Fig. 4c). Disse forsøkene indikerte at selv i fravær AV TCP var det en invers korrelasjon mellom iptg-konsentrasjonen og levedyktigheten av den rekombinante E. coli (Fig. 4a). Deg31-stammen led mer fra økende iptg-konsentrasjoner enn kontrollen, sannsynligvis på grunn av den ekstra byrden av å uttrykke gener som koder for den syntetiske banen. Det motsatte var sant etter 5 h inkubasjon fordi TCP-kataboliserende deg31-stammen var mer motstandsdyktig mot forverret toksisitet enn vertskontrollen (Fig. 4b, c). Den syntetiske veiestammen viste lignende overlevelsesrater ved alle testede iptg-konsentrasjoner bortsett fra den høyeste-den relative levedyktigheten av deg31 pre-indusert med 1 mM IPTG var 100 %. Vi antok at denne ytre verdien skyldtes undervurdering av antall levedyktige celler før inkubasjon på grunn av det intensive stresset som nedbryteren opplevde ved induksjon med en så høy konsentrasjon AV IPTG og den resulterende tilstedeværelsen av levedyktige, men ikke-dyrkbare celler i suspensjonen . Plating eksperimenter viste at en brøkdel av bakteriepopulasjonen gjenvunnet sin evne til å vokse og reprodusere litt tid etter behandling med denne høye konsentrasjonen AV IPTG (Tilleggsfil 1: Fig. S8).

tidskursene FOR TCP biotransformasjon med hvilende celler av deg31 pre-indusert med IPTG ved 1,00, 0,20, 0,05, 0,025 og 0,01 mM (Tilleggsfil 1: Fig . S7) og densitometrisk analyse AV sds polyakrylamidgeler med tilsvarende prøver av cellefrie ekstrakter (Tilleggsfil 1: Fig. S9, Tabell S1) viste at: (i) det relative forholdet mellom veienzymer og formen på degraderingsprofilen endret seg ikke vesentlig med induktorkonsentrasjonen, mens (ii) innholdet av de tre veienzymene i det totale oppløselige proteinet i de rekombinante bakteriene ble redusert fra 55% (1 mM IPTG) til 32% (0,01 mM IPTG) og veiens utgang ble redusert fra 70 til 46 %. Merkbar konvertering AV TCP ble også oppnådd med ikke-induserte celler på grunn Av lekkasjen Av T7-promotoren og basal ekspresjon av gener innenfor banen (Tilleggsfil 1: Fig. S7).

Figur 5 oppsummerer balansen mellom de tre parametrene som er omtalt i de foregående avsnittene: (i) vertens levedyktighet, (ii) det cellulære uttrykket av veienzymer og (iii) utgangen av den syntetiske bionedbrytningsruten. Vi konkluderer med at den minimale IPTG-konsentrasjonen som tillater tilstrekkelig ekspresjon av gener i veien for å oppnå en rimelig utgang, er 0,025 mM. Lignende induktorkonsentrasjoner som tillater full genuttrykk er rapportert for enkle rekombinante proteiner som β-galaktosidase, grønt fluorescerende protein og rhamnulose-1-fosfataldolase . Merk at IPTG-konsentrasjon på 0,025 mM er åtte ganger lavere enn den opprinnelig testede induktorkonsentrasjonen og opptil 40 ganger lavere enn verdiene rapportert i den vitenskapelige litteraturen som beskriver prosjektering av heterologe veier i E. coli . Induksjon med lavere mengder IPTG forbedret vertens kondisjon. Selv den laveste konsentrasjonen på 0,01 mM reduserte Imidlertid levedyktigheten Til e. coli-degraderen med 30 % i forhold til ikke-indusert deg31, og med opptil 50 % i forhold til ikke-indusert vertskontroll (P < 0,05 i begge tilfeller; Fig. 4b). Vi undersøkte derfor muligheten for å erstatte IPTG med en alternativ induktor.

Reduksjon av metabolsk byrde og toksisitetsforverring ved å indusere med laktose

Laktose er en naturlig induktor av lac-operonen og kan brukes som et billigere alternativ til syntetisk iptg. Det har vist seg å indusere ekspresjon av rekombinante proteiner I E. coli i samme grad som IPTG på både laboratorie-og industriell skala . I motsetning til iptg er laktose et substrat for β-galaktosidase (kodet av lacZ) og kan derfor metaboliseres av celler med intakt lac-operon, inkludert E. coli BL21 (DE3). Derfor brukes konsentrasjoner av laktose opp til 30 mM ofte for å indusere ekspresjon av klonede gener ved nivåer som kan oppnås med ≤1 mM IPTG .

vi undersøkte pre-induksjon av deg31-celler med 1 mM laktose. Vi antok at denne konsentrasjonen ville være tilstrekkelig til å indusere uttrykket AV TCP-degraderingsbanegenene på nivåer som ville gi tilstrekkelig nedbrytningseffektivitet. Denne forventningen ble bekreftet av registrerte tidskurser AV TCP biotransformasjon og funnet at veienzymer utgjorde opptil 41 % av cellens totale oppløselige protein under disse forholdene (Tilleggsfil 1: Fig. S7 og S9, Og Tabell S1). Den teoretiske omdannelsen AV TCP til glyserol under disse forholdene var 63 %. Disse verdiene er nær de som er observert for deg31-celler pre-indusert med 0,025 eller 0,05 mM IPTG. Viktigst av alt viste deg31-cellene pre-indusert med laktose høyere levedyktighet før og etter 5 h inkubasjon MED TCP sammenlignet med bakterier behandlet med IPTG ved noen av de testede konsentrasjonene (P < 0,05; Fig. 4). Den samme lindrende effekten ble observert for vertskontrollen. I løpet av overlevelsen utførte cellene pre-indusert med laktose nesten like godt som deres ikke-induserte motstykker (Fig. 4c). I tråd med platingsresultatene viste flowcytometrisk analyse av vertskontroll og deg31-celler som var preindusert med laktose, signifikant lavere nivåer av stressede celler med depolariserte membraner enn det som ble observert For E. coli-stammer som var preindusert med IPTG (P < 0,01; Tilleggsfil 1: Fig . S10). Disse resultatene indikerte igjen at virkningen AV IPTG i de studerte rekombinanter var konsekvent ledsaget av endringer i membranegenskaper.

en høyere levedyktighet av celler indusert med laktose i stedet FOR IPTG ble tidligere rapportert for ekspresjon av enkle heterologe proteiner . Denne effekten ble tilskrevet den forsinkede, mildere induksjonen oppnådd med den naturlige induktoren. I motsetning til syntetisk IPTG, som raskt kan komme inn i cellen både ved passiv diffusjon og ved Hjelp av lacy laktose permease, kan laktose bare komme inn i cytoplasma via permease. Videre må laktose omdannes til allolaktose ved β-galaktosidase før den bindes til lac-undertrykkeren, mens iptg bindes direkte til undertrykkeren. Våre resultater bekrefter at laktose pålegger en lavere metabolsk byrde enn IPTG, noe som tyder på at det også er en mer egnet induktor for uttrykk for hele heterologe veier I E. coli BL21(DE3). Dette er spesielt viktig For E. coli BL21 (DE3) celler som bærer syntetiske veier som nedbryter giftige forbindelser eller produserer giftige mellomprodukter.