Gelfiltreringskromatografi

Gelfiltreringskromatografi Applikasjoner

Gelfiltreringskromatografi, en type størrelseskromatografi, kan brukes til enten å fraksjonere molekyler og komplekser i en prøve i fraksjoner med et bestemt størrelsesområde, for å fjerne alle molekyler som er større enn en bestemt størrelse fra prøven, eller en kombinasjon av begge operasjoner. Gelfiltreringskromatografi kan brukes til å skille forbindelser som små molekyler, proteiner, proteinkomplekser, polysakkarider og nukleinsyrer når de er i vandig oppløsning. Når et organisk løsningsmiddel brukes som mobilfase, blir prosessen i stedet referert til som gelpermeasjonskromatografi.

Gelfiltreringskromatografi kan også brukes til:

• Fraksjonering av molekyler og komplekser innenfor et forhåndsbestemt størrelsesområde
• Størrelsesanalyse og bestemmelse
• Fjerning av store proteiner og komplekser
• Bufferutveksling
• Avsalting
• Fjerning av små molekyler som nukleotider, primere, fargestoffer og forurensninger
• vurdering av prøvens renhet
• separasjon av bundet fra ubundne radioisotoper

gelfiltreringskromatografimedier for alle de ovennevnte bruksområdene er tilgjengelige i forpakket gravity flow-kolonner, Spin-kolonner, lavtrykk og medium-trykk kromatografi kolonner, og flaske harpiks.

Gelfiltreringskromatografimekanisme

i en gelfiltreringskromatografikolonne består den stasjonære fasen av en porøs matrise, og mobilfasen er bufferen som strømmer inn mellom matriksperlene. Perlene har et definert porestørrelsesområde, kjent som fraksjoneringsområdet. Molekyler og komplekser som er for store til å komme inn i porene, forblir i mobilfasen og beveger seg gjennom kolonnen med bufferstrømmen. Mindre molekyler og komplekser som er i stand til å bevege seg inn i porene, går inn i den stasjonære fasen og beveger seg gjennom gelfiltreringskolonnen ved en lengre bane gjennom porene i perlene.

ethvert molekyl eller kompleks som er over fraksjonering området for en bestemt gel filtrering kromatografi kolonne vil bevege seg gjennom kolonnen raskere enn noen molekyl som kan angi den stasjonære fasen. Derfor vil enhver bestanddel i prøven som er over fraksjoneringsområdet elueres først (i tomromsvolumet) før alt som er i fraksjoneringsområdet. Minimumsstørrelsen som vil forbli i mobilfasen og ikke gå inn i den stasjonære fasen, kalles ekskluderingsgrensen. Bio-Rad tilbyr gelfiltreringskromatografimedier og kolonner med ekskluderingsgrenser som spenner over tre størrelsesordener, fra 100 dalton til 100 000 dalton (100 kDa).

Molekyler og komplekser som kan gå inn i den stasjonære fasen, vil bli fraksjonert i henhold til deres størrelser. Mindre molekyler vil migrere dypt inn i porene og vil bli forsinket mer enn større molekyler som ikke så lett kommer inn i porene, og blir dermed eluert fra kolonnen raskere. Denne forskjellen i poremigrasjon fører til fraksjonering av komponenter etter størrelse med den største elueringen først.

i gelfiltreringskromatografikolonner designet for avsaltning, bufferutveksling og fjerning av små molekyler som nukleotider, kommer saltene og de små forbindelsene lett inn i porene, retarderes og migrerer langsommere gjennom kolonnen enn de større proteinene eller nukleinsyrene. Derfor elueres komponentene av interesse i prøven på forhånd av salter, nukleotider, etc. DNA opprydding kits ved hjelp av denne mekanismen inneholder ofte gel filtrering spin kolonner.

Oppløsning, her definert som skarpheten av grensene mellom størrelsesfraksjoner, bestemmes av perlestørrelse og en rekke andre faktorer. Mindre perle størrelse gir generelt høyere oppløsning i en gel filtrering kromatografi kolonne. Kompakte molekyler diffunderer gjennom den stasjonære fasen raskere enn lineære molekyler. Størrelsesekskludering, fraksjoneringsområde og elueringshastighet påvirkes av buffersammensetning, ionisk styrke og pH. for fraksjonering av komplekse blandinger av proteiner må elueringstider og størrelsesekskluderingsgrenser bestemmes empirisk.

Gelfiltreringskromatografi Media

et viktig kriterium for gelfiltreringskromatografi media er at media er inert og at ingenting i prøven eller noen buffer binder seg til media. En annen vurdering er typen gel filtrering kolonnen brukes og om det er brukt i en trykk kromatografi system eller tyngdekraften flyt eller spin kolonner. Hvis et trykkromatografisystem brukes, må både kolonnen og mediet kunne tåle trykk og strømningshastigheter som brukes.

Vanlige medier for gelfiltreringskromatografi er basert på agarose-eller polyakrylamidperler, dekstrose for tyngdekraft-eller lavtrykkssystemer, og polymere harpikser for mediumtrykkssystemer. Valget av media avhenger av egenskapene til komponentene som skal skilles og andre eksperimentelle faktorer. Følgende er generelle hensyn når du bestemmer valget av gelfiltreringskromatografi media:

• Fraksjoneringsområde
• størrelsesekskluderingsgrense
• driftstrykk
• Gjennomstrømningshastighet
• prøveviskositet
• pH-område
• Autoklaverbarhet
• Toleranse for vannblandbar organiske løsemidler; noen prøver kan være mer løselige i en vann-organisk blanding
• toleranse for vaskemidler, kaotrope midler, formamid, etc.
• Driftstemperatur

typene prøver, valg av medier og kromatografisystemoppsett vil avgjøre hvilke parametere som er viktigst for et gitt renseprogram.