Plasmider 101: codon usage bias

en lignende genetisk kode brukes av De fleste organismer på Jorden, men forskjellige organismer har forskjellige preferanser for kodonene de bruker til å kode spesifikke aminosyrer. Dette er mulig fordi det er 4 baser (A, T, C Og G) og 3 posisjoner i hvert kodon. Det er derfor 64 mulige kodoner, men bare 20 aminosyrer og 3 stoppkodoner for å kode, slik at 41 kodoner ikke er gjort rede for. Resultatet er redundans; flere kodoner kode enkelt aminosyrer. Evolusjonære begrensninger har støpt som kodoner brukes fortrinnsvis i hvilke organismer-organismer har kodon bruk bias.

du finner mange kodontabeller som viser hvilke kodoner som koder for hvilke aminosyrer (se eksempel til høyre). Med slike enkle regler kan du tro at det er lett å komme opp med EN brukbar DNA-sekvens for å kode ditt peptid av interesse og produsere det peptidet i din valgte organisme. Dessverre gjør kodonpreferanser det slik at du ikke kan velge blant de mulige kodonene tilfeldig og forvente at sekvensen din uttrykker seg godt i enhver organisme.

så hva er de evolusjonære begrensningene som fører til disse preferansene, og hva kan vi gjøre med dem? Les videre for å finne ut!

hvorfor har organismer forskjellige kodonbruksforstyrrelser?

årsakene til varierte kodonpreferanser blant organismer er ikke helt forstått, men noen mulige årsaker inkluderer:

1. Metabolisk trykk-det tar cellulære ressurser å produsere trnaer som gjenkjenner forskjellige kodoner, modifiserer trnaene riktig og lader trnaene med de riktige aminosyrene. Hvis en organisme bare bruker en delmengde av kodoner, trenger den bare å produsere en delmengde av ladede trna og kan derfor trenge færre ressurser for hele oversettelsesprosessen. For eksempel, Under høye vekstforhold, oppregulerer E. coli fortrinnsvis produksjon av trna som gjenkjenner kodoner funnet i høyt uttrykte gener (Emilsson og Kurland, 1990).
2. Kontrollere genuttrykk gjennom gensekvens – Proteiner som er kodet av kodoner med lav overflod eller dårlig ladede trnaer, kan produseres med lavere hastighet enn proteiner kodet av svært rikelig, ladede trnaer. For eksempel Tuller et al. funnet at oversettelseseffektivitet er godt korrelert med codon bias i Både E. coli og s. cerevisiae.
3. proteinfolding – hvis et protein er kodet av en blanding av kodoner med svært og dårlig ladede trnaer, kan forskjellige regioner av proteinet oversettes til forskjellige priser. Ribosomet vil bevege seg raskt langs regioner som krever rikelig, ladet tRNAs, men vil stanse på regioner som krever lav overflod, dårlig ladet tRNAs. Når ribosomet staller, kan dette gi de raskt oversatte områdene en sjanse til å kaste seg riktig. For eksempel Pechmann og Frydman fant at traktater av ikke-optimale kodoner er forbundet med spesifikke sekundære strukturer i 10 nært beslektede gjærstammer.
4. Tilpasning til endrede forhold-Organismer må ofte uttrykke gener på forskjellige nivåer under forskjellige forhold. Med variert kodonbruk kan en organisme endre hvilke proteiner som er sterkt uttrykt og som er dårlig uttrykt ved å produsere og lade bestemte tRNA-bassenger. For eksempel kan trnaer som brukes i gener som koder for aminosyrebiosyntetiske enzymer, fortrinnsvis lades under aminosyresulting, noe som resulterer i høyere produksjon av aminosyrebiosyntetiske enzymer (Dittmar et al., 2005).

hvordan påvirker codon usage bias mine eksperimenter?

mens kodonpreferanser kan være svært nyttige for organismer, kan de være problematiske for forskere som prøver å uttrykke proteiner i heterologe verter. Hvis du bare forsterker et gen av interesse fra det menneskelige genomet, kan Det for eksempel ikke uttrykke i Det Hele tatt I E. coli(du kan finne en rekke databaser som viser ulike organismers kodonpreferanser online). Selv om genet er oversatt, kan det ikke fungere ordentlig. Dette er resultatet av en mismatch mellom menneskelig og E. coli kodon preferanse. Noen kodoner som vanligvis brukes hos mennesker, er ikke vanlige i E. coli og omvendt. Når man oversetter disse kodonene, kan ribosomet derfor stanse på upassende steder eller unnlate å gjøre det gjennom hele transkripsjonen, noe som resulterer i produksjon av henholdsvis ikke-funksjonelle proteiner og proteinfragmenter.

Løse problemet med codon usage bias – codon optimalisering og uttrykk for alternative tRNAs

Codon optimalisering

med lavpris DNA syntese, en av de primære måter forskere løse problemet med codon valg er å resyntetisere gener på en slik måte at deres kodoner er mer hensiktsmessig for den ønskede uttrykk vert. Dette er kjent som » codon optimalisering.»Selv om det er enkelt i teorien, er dette ikke så enkelt som det høres ut. Selv for relativt korte peptider kan det være mange mulige måter å kode dem på, og hva som utgjør «passende» kodon er ikke nødvendigvis åpenbart.

du tenker kanskje, » Tull! Jeg burde bare velge kodonet med det mest omfattende bassenget av ladede trnaer i vertsorganismen min for hver aminosyre jeg vil kode, » men som beskrevet ovenfor, bør ikke alle områder av et protein nødvendigvis oversettes raskt for å produsere et protein som fungerer som det skal.

Du kan da tenke, «Ok, Jeg skal bare sørge for at overflodene av kodonene jeg velger for verten, samsvarer med overflodene av kodoner som brukes i den innfødte organismen.»Dette er muligens en bedre ide og har blitt brukt med hell i det siste (Angov et al., 2008), men det er fortsatt mange flere funksjoner å vurdere når du designer et fullt gen. En ikke-uttømmende liste inkluderer:

• kodon overflod i forhold til beslektet tRNA overflod
• Repeterende sekvenser
• Restriksjonssteder
• Sekvenser utsatt for å skape sekundære strukturer I RNA transkripsjoner
• Effekter på transkripsjon (husk, det handler ikke bare om oversettelse – f. eks.)

Som du kanskje kan forestille deg, er det ikke lett for mennesker å balansere alle disse faktorene alene. Heldigvis har mange forskere opprettet kodonoptimaliseringsalgoritmer og DNA-syntese selskaper som IDT og GenScript host online codon optimaliseringsverktøy. Husk at bare fordi du optimaliserer et gen med et av disse verktøyene, betyr det ikke nødvendigvis at genet kommer til å uttrykke seg godt. Hvis du får godt uttrykk, bør du også funksjonelt analysere proteinet som produseres for å sikre at det har brettet riktig.

du kan kanskje unngå å få genene dine av interesse kodon optimalisert ved å bestille plasmider som inneholder Dem fra Addgene. Hvis et plasmid ved Addgen inneholder et gen som er blitt kodon optimalisert for en bestemt organisme, vil dette noen ganger (men ikke alltid) bli notert i i» mutasjon » – feltet på plasmid-siden(se plasmid 87904 for eksempel). Siden mange plasmider tilgjengelig Fra Addgene nå har fullsekvensdata, anbefaler vi direkte å analysere gensekvenser for kodonoptimalisering og egnethet for uttrykksverten din før du bruker dem i forsøkene dine.

Uttrykk for alternative trnaer

hvis du ikke har tid eller midler til å syntetisere en kodonoptimalisert versjon av ditt gen av interesse, er det mulig å overexpress lav overflod trnaer i uttrykksverten din og dermed øke deres overflod. For eksempel uttrykker de kommersielle Rosetta E. coli-stammene en rekke trnaer som normalt finnes i lav overflod I E. coli.

fordelen med å produsere ekstra trnaer er at man kan bruke samme uttrykkssystem for mange forskjellige gener uten å måtte lage nye konstruksjoner. På grunn av problemer som feilaktige oversettelseshastigheter og potensielle effekter på cellevekst, kan selv verter som produserer alternative trnaer ikke uttrykke tilstrekkelige mengder protein av interesse.

Uansett hvilken metode du velger for å overvinne problemene rundt kodonvalg, bør du ha en metode for å sikre at proteinene du produserer fungerer som de skal. Overuttrykk kan resultere i produksjon av uoppløselige, ikke-funksjonelle globs av protein kjent som inkluderingsorganer som generelt vil segregere med cellepellet under renseprosedyrer. Selv om du produserer en stor mengde protein i expression-verten, bør du utføre en funksjonell analyse for å sikre at proteinet ditt ikke danner inklusjonsorganer og foldes riktig.

1. Angov, Evelina, et al. «Heterologt proteinuttrykk forsterkes ved å harmonisere kodonbruksfrekvensene til målgenet med de av uttrykksverten.»PloS one 3.5 (2008): e2189. PubMed PMID: 18478103. PubMed Sentral PMCID: PMC2364656.

2. Dittmar, Kimberly A., et al. «Selektiv lading av trna isoacceptorer indusert av aminosyre sult.»EMBO rapporterer 6.2 (2005): 151-157 . PubMed PMID: 15678157. PubMed Sentral PMCID: PMC1299251.

3. Emilsson, Valur Og Charles G. Kurland. «Vekstraten avhengighet av overføring RNA overflod I Escherichia coli.»THE EMBO journal 9.13 (1990): 4359-4366. PubMed PMID: 2265611. PubMed Sentral PMCID: PMC552224.

4. I tillegg til å være en av de mest populære. «Codon bias og heterologt proteinuttrykk.»Trender i bioteknologi 22.7 (2004): 346-353 . PubMed PMID: 15245907.

5. Trueblood, Barbara, et al. «Genoptimaliseringsmekanismer: en multi-genstudie avslører en høy suksessrate for full lengde humane proteiner uttrykt I Escherichia coli.»Proteinvitenskap 19.7 (2010): 1312-1326. Publisert PMID: 20506237. PubMed Sentral PMCID: PMC2970903.

6. Pechmann, Sebastian Og Judith Frydman. «Evolusjonær bevaring av kodonoptimalitet avslører skjulte signaturer av cotranslational folding.»Natur strukturelle & molekylærbiologi20.2 (2013): 237. PubMed PMID: 23262490. PubMed Sentral PMCID: PMC3565066.

7. Quax, Tessa EF, et al. «Codon bias som et middel til å finjustere genuttrykk.»Molekylær celle 59.2 (2015): 149-161 . PubMed PMID: 26186290. PubMed Sentral PMCID: PMC4794256.

• denne anmeldelsen gir en flott oversikt over codon usage bias

8. Tønsberg, tønsberg, et al. «Oversettelseseffektiviteten bestemmes av både codon bias og folding energy.»Proceedings Av National Academy Of Sciences 107.8 (2010): 3645-3650 . PubMed PMID: 20133581. PubMed Sentral PMCID: PMC2840511.