Klassisk, for å utføre en radioimmunoassay, blir en kjent mengde av et antigen radioaktivt, ofte ved å merke det med gamma-radioaktive isotoper av jod, som 125-I, festet til tyrosin. Dette radiomerkede antigenet blandes deretter med en kjent mengde antistoff for det antigenet, og som et resultat binder de to spesifikt til hverandre. Deretter tilsettes en prøve av serum fra en pasient som inneholder en ukjent mengde av det samme antigenet. Dette fører til at det umerkede (eller» kalde») antigenet fra serumet konkurrerer med det radiomerkede antigenet («hot») for antistoffbindingssteder. Etter hvert som konsentrasjonen av» kaldt » antigen økes, binder mer av det seg til antistoffet, fortrenger den radiomerkede varianten, og reduserer forholdet mellom antistoffbundet radiomerketantigen til fritt radiomerketantigen. De bundne antigenene separeres deretter og radioaktiviteten til det frie (ubundne) antigenet som er igjen i supernatanten, måles ved hjelp av en gammateller.
denne metoden kan brukes til ethvert biologisk molekyl i prinsippet og er ikke begrenset til serumantigener, og det er heller ikke nødvendig å bruke den indirekte metoden for måling av det frie antigenet i stedet for direkte måling av det fangede antigenet. For eksempel, hvis det er uønsket eller ikke mulig å radiomerke antigenet eller målmolekylet av interesse, kan EN RIA gjøres hvis to forskjellige antistoffer som gjenkjenner målet er tilgjengelige og målet er stort nok (f.eks. et protein) til å presentere flere epitoper til antistoffene. Ett antistoff ville bli radiomerket som ovenfor, mens det andre ville forbli umodifisert. RIA ville begynne med at det «kalde» umerkede antistoffet fikk lov til å samhandle og binde seg til målmolekylet i oppløsning. Fortrinnsvis er dette umerket antistoff immobilisert på noen måte, slik som koblet til en agarose perle, belagt til en overflate, etc. Deretter tillates det» varme » radiomerkede antistoffet å interagere med det første antistoff-målmolekylkomplekset. Etter omfattende vasking måles den direkte mengden radioaktivt antistoffbundet og mengden målmolekyl kvantifiseres ved å sammenligne det med en referansemengde analysert samtidig. Denne metoden ligner i prinsippet den ikke-radioaktive sandwich ELISA-metoden.