2-d elektroforese begynner med elektroforese i den første dimensjonen og separerer deretter molekylene vinkelrett fra den første for å lage et elektroferogram i den andre dimensjonen. I elektroforese i den første dimensjonen separeres molekyler lineært i henhold til deres isoelektriske punkt. I den andre dimensjonen separeres molekylene ved 90 grader fra det første elektroferogrammet i henhold til molekylmasse. Siden det er usannsynlig at to molekyler vil være like i to forskjellige egenskaper, separeres molekyler mer effektivt i 2-d elektroforese enn i 1-D elektroforese.
de to dimensjonene som proteiner separeres til ved hjelp av denne teknikken, kan være isoelektriske punkt, proteinkompleksmasse i den opprinnelige tilstanden eller proteinmasse.
Separasjon av proteinene ved isoelektrisk punkt kalles isoelektrisk fokusering (IEF). Dermed påføres en pH-gradient på en gel og et elektrisk potensial påføres over gelen, noe som gjør den ene enden mer positiv enn den andre. Ved alle andre pH-verdier enn deres isoelektriske punkt vil proteiner bli ladet. Hvis de er positivt ladet, vil de bli trukket mot den mer negative enden av gelen, og hvis de er negativt ladet, vil de bli trukket til den mer positive enden av gelen. Proteinene som påføres i den første dimensjonen vil bevege seg langs gelen og vil akkumulere ved deres isoelektriske punkt; det vil si punktet hvor den totale ladningen på proteinet er 0 (en nøytral ladning).
for analyse av proteiners funksjon i en celle er kunnskapen om samarbeidet avgjørende. Ofte virker proteiner sammen i komplekser for å være fullt funksjonelle. Analysen av denne suborganelle organiseringen av cellen krever teknikker som bevarer den opprinnelige tilstanden til proteinkompleksene. I native polyakrylamid gel elektroforese (native SIDE) forblir proteiner i sin opprinnelige tilstand og separeres i det elektriske feltet etter deres masse og massen av deres komplekser henholdsvis. For å oppnå en separasjon etter størrelse og ikke etter nettladning, som i IEF, overføres en ekstra kostnad til proteinene ved Bruk Av Coomassie Brilliant Blue eller litiumdodecylsulfat. Etter fullføring av den første dimensjonen ødelegges kompleksene ved å anvende denatureringen AV SDS-SIDEN i den andre dimensjonen, hvor proteinene som kompleksene består av, separeres av deres masse.
før separering av proteinene etter masse, behandles de med natriumdodecylsulfat (SDS) sammen med andre reagenser (SDS-SIDE i 1-D). Dette denaturerer proteinene (det vil si, det utfolder dem i lange, rette molekyler) og binder et antall sds-molekyler omtrent proporsjonalt med proteinets lengde. Fordi et proteins lengde (når det utfoldes) er omtrent proporsjonal med massen, tilsvarer dette å si at det fester et antall sds-molekyler omtrent proporsjonalt med proteinets masse. SIDEN SDS-molekylene er negativt ladet, er resultatet av dette at alle proteinene vil ha omtrent samme masse-til-ladningsforhold som hverandre. I tillegg vil proteiner ikke migrere når de ikke har ladning (et resultat av det isoelektriske fokuseringstrinnet), derfor tillater belegget av proteinet I SDS (negativt ladet) migrering av proteinene i den andre dimensjonen (SDS-SIDE, den er ikke kompatibel for bruk i den første dimensjonen som den er ladet og et ikke-ionisk eller zwitterionisk vaskemiddel må brukes).i den andre dimensjonen påføres et elektrisk potensial igjen, men i en 90 graders vinkel fra det første feltet. Proteinene vil bli tiltrukket av den mer positive siden av gelen (FORDI SDS er negativt ladet) proporsjonalt med deres masse-til-ladningsforhold. Som tidligere forklart, vil dette forholdet være nesten det samme for alle proteiner. Proteinenes fremgang vil bli redusert av friksjonskrefter. Gelen virker derfor som en molekylsikt når strømmen påføres, separerer proteinene på grunnlag av deres molekylvekt med større proteiner som beholdes høyere i gelen og mindre proteiner kan passere gjennom sikten og nå lavere områder av gelen.