1 Introduksjon
Gener for transmembrane proteiner (TMPs) utgjør 20-30% av de fleste genomer (Wallin & Heijne, 1998), og Basert på deres kritiske roller i cellefysiologi, Er TMPs målene for en stor brøkdel av klinisk nyttige legemidler. Dermed er bestemmelse av deres strukturer og virkemåter av stor betydning. Antallet tilgjengelige TMP-strukturer med høy oppløsning forblir imidlertid relativt lavt (Se Nettsiden Til Stephen White; http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/). To forklaringer som ofte påberopes for vanskeligheten med å oppnå veldiffraksjonskrystaller Av TMPs for bruk I røntgendiffraksjonsstudier er (1) TMPs er strukturelt dynamiske med fleksible regioner som gjør det vanskelig for proteinet å vedta den ensartede konformasjonen som kreves for pakking i en krystall; og (2) overflater av transmembranregioner Av TMPs deltar ikke så lett som overflatene av globulære oppløselige proteiner i protein-proteininteraksjoner som kreves for krystallpakking. Innføring av et stabilt løselig protein i et overflateeksponert område av EN TMP gir en måte å potensielt omgå begge disse problemene, siden en slik innsetting på et internt sted i EN TMP kan redusere total fleksibilitet og siden tilstedeværelsen av et lett krystalliserbart løselig domene kan gi intermolekylære kontakter som kreves for krystallisering(Chun et al ., 2012; Engel, Chen, & Privé, 2002).
Fusjon Av t4 lysozym (T4L) på interne steder I TMPs har hittil gitt en vellykket tilnærming til bestemmelse av strukturer av ulike medlemmer av den viktige GPCR superfamilien (Cherezov et al., 2007; Chien et al., 2010; Dore et al., 2014; Geir et al., 2014; Granier et al., 2012; Haga et al., 2012; Hanson et al., 2012; Hollenstein et al., 2013; Jaakola et al., 2008; Kruse et al., 2012; Manglik et al., 2012; Rosenbaum et al., 2007, 2011; Shimamura et al., 2011; Tan et al., 2013; Wacker et al., 2013; Wang et al., 2013; White et al., 2012; Wu et al., 2010, 2012; Xu et al., 2011; Zhang et al., 2012). Lignende interne fusjoner av en termisk stabilisert apocytokrom b (Wacker et al., 2013; Wang et al., 2013; Zhang, Zhang, Gao, Paoletta et al., 2014; Zhang, Zhang, Gao, Zhang, Et al., 2014) og rubredoxin (Tan Et al., 2013) har også gitt GPCR strukturer. I tillegg har flere GPCR-strukturer blitt oppnådd ved krystallisering av konstruksjoner der den stabiliserende proteinpartneren ble smeltet ved n-terminus av reseptorsekvensen, i stedet for i en intern posisjon (Fenalti et al., 2014; Rasmussen, Choi, et al., 2011; Rasmussen, DeVree, et al., 2011; Siu et al., 2013; Thomas Et al., 2012; Wu et al., 2014), noe som tyder på at fusjonsproteinens rolle i tilrettelegging av dannelse av intermolekylære kontakter kan være viktigere for å fremme krystallisering enn reduksjon AV tmp fleksibilitet. Alternative tilnærminger for å oppnå GPCR strukturer som ikke involverer bruk av fusjonsproteiner har inkludert cokrystallisering med anti-reseptor antistoffer (Kruse et al., 2013; Rasmussen, Choi, et al., 2011; Rasmussen et al., 2007; Rasmussen, DeVree, et al., 2011; Ring et al., 2013) og krystallisering AV GPCR-varianter som har blitt termostabilisert ved innføring av punktmutasjoner og slettinger (Egloff et al., 2014; Scott, Kummer, Tremmel, & Pluckthun, 2013; Tate, 2012). Faktisk har de fleste fusjonsproteinholdige GPCR-varianter som brukes til vellykket strukturbestemmelse, også innarbeidet punktmutasjoner og avkortinger designet for ytterligere å forbedre proteinstabiliteten og redusere fleksibiliteten.
Innsetting av stabile oppløselige proteiner i TMPs med det formål å fremme krystallisering har generelt blitt utført som en innsetting eller erstatning for rester i DEN tredje intracellulære (IC3) sløyfen Av GPCRs. Dette er basert på en forventning om at denne regionen i reseptorer er fleksibel og kan styre den relative bevegelse av omkringliggende helikser (Rosenbaum et al., 2007), samt redusere sannsynligheten for at innsetting av fusjonspartneren vil forstyrre den samlede GPCR-strukturen (Chun et al., 2012). Mens slike innsettinger ofte ikke forstyrrer de samlede strukturer av reseptorer (basert på retensjon av minst noen ligandbindingsaffinitet ved fusjonskonstruksjonene), resulterer de generelt i tap av evnen til å aktivere det beslektede trimeric G-proteinet (Rosenbaum et al., 2007), noe som ikke er overraskende siden IC3-sløyfen ofte er stedet for funksjonelle interaksjoner mellom GPCRs og trimeric G-proteiner som er deres umiddelbare nedstrøms effektorer. Videre er kriteriene for å etablere bestemte koblingssteder for innsetting av fusjonsproteiner og for å bestemme mengden av reseptorsekvens som de erstatter, ikke godt etablert. En vellykket fusjon må gi en optimal match mellom avstanden og orienteringen Av N – og C-termini av det innsatte proteinet og kryssstedene i GPCR (Chun et al ., 2012; Engel et al., 2002). Dermed kan opprettelse av en nyttig fusjon kreve syntese eller konstruksjon av flere versjoner av smeltede gener (Rosenbaum et al., 2007).
vi beskriver her en strategi for å generere og screene et bibliotek med variantformer av en reseptor som inneholder innsettinger AV T4L på forskjellige punkter I DEN tredje intracellulære (IC3) sløyfen som erstatning for forskjellige antall aminosyrerester i sløyfesekvensen (Mathew, Ding, Naider, & Dumont, 2013). Ved å uttrykke reseptorer i gjær, er det mulig å lage randomiserte biblioteker av varianter med lysozyminnsatser og å screene direkte for konstruksjoner med maksimale totale uttrykksnivåer, antall ligandbindingssteder på celleoverflaten og til og med reseptorfunksjon, analysert basert på aktivering Av det beslektede g-proteinet. Tilnærmingene var vellykket i å identifisere reseptorer med innsettinger I IC3 loop som beholder nesten full signalfunksjon. Dette antyder at NÅR t4l-molekylet festes via passende koblingssekvenser, kan det settes inn i denne sløyfen uten å hindre tilgang Av g-proteinet til relevante overflater av den aktiverte reseptoren.
de beskrevne protokollene ble utviklet Ved Hjelp Av Ste2p, en endogen GPCR av gjær Saccharomyces cerevisiae brukt som et medgjørlig innledende system som ingen tredimensjonal struktur er tilgjengelig ennå. Imidlertid kan lignende tilnærminger brukes til å identifisere innsettingsholdige varianter av de mange pattedyrs GPCRs som har blitt rapportert å være i stand til å aktivere gjærferomonresponsveien (Brown et al., 2000; Dowell & Brown, 2009; King, Dohlman, Thorner, Caron, & Lefkowitz, 1990; Pausch, 1997), eller til andre TMPs som det er mulig å analysere for funksjon i intakte celler. Videre har gjærarter blitt brukt som uttrykkssystemer for strukturbestemmelse Av GPCRs og andre TMPs (Clark et al., 2010), inkludert for bestemmelse av krystallstrukturen av den humane h1 histaminreseptoren (Shimamura et al., 2011; Shiroishi et al., 2011). Ste2p er reseptoren for feromonparing av gjær, et peptid med 13 rester. Binding av denne ligand resulterer i aktivering av et cytoplasmatisk heterotrimerisk g-protein, som i sin tur aktiverer EN MAP-kinase-vei, som til slutt fører til transkripsjonelle responser, endringer i celleform, cellesyklusarrest og fusjon med gjærceller av motsatt parringstype.