Exacerbaties van substraat toxiciteit door IPTG in Escherichia coli BL21(DE3) het dragen van een synthetische stofwisseling

Biotransformatie van TCP rusten E. coli BL21(DE3) cellen dragen varianten van een synthetische afbraak pad

Varianten van de synthetische pad met het wild-type haloalkane dehalogenase of de 26-voudig katalytisch efficiënter mutant DhaA31 werden geïntroduceerd in E. coli BL21(DE3) . Deze gastheer werd geselecteerd omdat noch de enzymen, noch de metabolieten van de TCP-route van nature in zijn metabolisch netwerk voorkomen en vanwege het brede repertoire van commercieel beschikbare Duetvectoren voor deze stam, die de afstembare co-expressie van meerdere genen in een enkele cel mogelijk maken . Dit resulteerde in de bouw van een flexibel systeem met beperkt risico van metabolische cross-talk, waarin de uitdrukking van de drie wegcomponenten orthogonaal kan worden gemanipuleerd . Drie eerder geconstrueerde E. coli BL21 (DE3) afbraakstoffen als degWT, deg31 en deg31opt werden getest (Tabel 1). E. coli degWT draagt een variant van de TCP-route op basis van het wild – type DhaA samen met HheC en EchA, uitgedrukt in een relatieve verhouding van respectievelijk 0,24:0,36:0,40, zoals bepaald na pre-inductie met 0,2 mM IPTG (aanvullend dossier 1: Fig. S1). De stammen deg31 en deg31opt dragen beide de TCP-route met de gemanipuleerde Dehalogenase DhaA31, maar de relatieve verhouding van de drie enzymen in deg31 is 0,14: 0,41: 0,45 terwijl in deg31opt het 0,63:0,16:0,21 is. Uit experimenten met natriumdodecylsulfaat polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE) bleek dat de drie pathway-enzymen samen een vergelijkbaar deel van de totale oplosbare eiwitfractie die door alle drie de afbraakproducten wordt geproduceerd, voor hun rekening namen: 52% voor degWT, 54% voor deg31 en 44% voor deg31opt.

Pre-geïnduceerde (0.2 mM IPTG) rustcellen van elk van de recombinante stammen en een gastheer controle (Tabel 1) werden geïncubeerd in fosfaatbuffer met 2 mM TCP, en de tijd-kuren van TCP biotransformatie over een 5 uur interval werden geregistreerd (Fig. 1). De reactieprofielen toonden fundamentele verschillen aan tussen de stammen met betrekking tot de initiële snelheid van TCP dehalogenatie, accumulatie van tussenproducten en de algehele efficiëntie van glycerolvorming. De theoretische concentraties van glycerol, anders snel gebruikt door E. coli, kan worden berekend uit de experimentele concentraties van TCP en gedetecteerde tussenproducten op grond van de orthogonale aard van de route . Terwijl deg31opt profiteerde van de snelste eerste stap (Fig. 1d), de beste uitgebalanceerde route met de hoogste glycerolproductie was deg31 (Fig. 1c). Aan de andere kant leed degWT aan trage TCP-conversie (Fig. 1b), langdurige blootstelling aan het toxische substraat en onvoldoende output van de route. Zoals verwacht, de gastheer controle (het dragen van de overeenkomstige lege plasmiden, Fig. 1a) toonde geen activiteit in de richting van TCP in het gesloten batchsysteem.

de drie E. recombinanten van coli en de controlestam zonder synthetische route vormen een geschikt modelsysteem voor het bestuderen van de bijdrage van metabole belasting en substraat/metaboliet toxiciteit aan de fitness kosten van TCP biotransformatie door hele-cel katalysatoren.

beoordeling van metabole belasting en effecten op substraattoxiciteit door plating

de levensvatbaarheid van cellen, geschat door plating, is een belangrijke fysiologische parameter die het vermogen van de individuele stammen moet weerspiegelen om de door de metabole belasting en de blootstelling aan TCP veroorzaakte belasting het hoofd te bieden . E. coli degradeert pre-geïnduceerd met 0.2 mM IPTG en host controles werden geplateerd voor en na 5 uur incubatie in fosfaatbuffer met of zonder 2 mM TCP. Het percentage overlevende cellen werd berekend na incubatie.

de gegevens verkregen door beplating vóór incubatie (Fig. 2a) illustreren de afzonderlijke effecten van individuele elementen van de totale metabolische belasting opgelegd aan de cellen. Verscheidene factoren, met inbegrip van de aanwezigheid van plasmidedna en de bijbehorende selectiemarkers, de toevoeging van IPTG, en de last toe te schrijven aan heterologe weguitdrukking beà nvloedden de levensvatbaarheid van de afbraakders parallel zelfs vóór de toevoeging van het giftige substraat. Het meest uitgesproken effect in dit stadium was toe te schrijven aan plasmidebehoud en de bijbehorende constitutieve uitdrukking van genen van de selectiemarker van de duetvectoren, evenals de aanwezigheid van IPTG. De aanwezigheid van twee middelgrote tot hoge plasmiden pCDF (20-40 kopieën per cel) en pETDuet (~40 kopieën per cel) verminderde levensvatbaarheid met 50 % (P < 0,01; Fig. 2 bis). De “pre-inductie” van de gastheercontrole met lege plasmiden verminderde de levensvatbaarheid met bijna 40% ten opzichte van de niet-geïnduceerde controle (P < 0,01). De expressie van pathway enzymen in de E. coli degradeert verder verminderde levensvatbaarheid met ongeveer 20 % (P < 0,05). Een extra vermindering van de levensvatbaarheid van deg31opt in vergelijking met degWT en deg31 kan mogelijk worden toegeschreven aan het verschil in antibioticakeuze markers tussen drie recombinanten.

de gegevens verzameld na 5 uur incubatie met of zonder TCP (Fig. 2b en aanvullend bestand 1: Fig. S2) bevat verschillende onverwachte observaties. Verrassend genoeg had TCP (aanvankelijk toegevoegd bij een concentratie van 2 mM) slechts geringe of verwaarloosbare effecten op de levensvatbaarheid van niet-geïnduceerde controlecellen met lege plasmiden; er was geen significant verschil in levensvatbaarheid tussen deze cellen en de gastheercontroles die werden blootgesteld aan noch TCP noch IPTG. Dit was onverwacht omdat TCP is gemeld om sterk groeiende cellen van E. coli BL21(DE3) en natuurlijke gastheren zoals A. radiobacter AD1 of Pseudomonas putida MC4 zelfs bij concentraties 50% lager dan die hier gebruikt remmen . Aan de andere kant was het schadelijke effect van IPTG statistisch significant (P < 0,01) (Fig. 2b en aanvullend bestand 1: Fig. S2). De meest opvallende constatering was dat de relatieve levensvatbaarheid van cellen die vooraf werden geïnduceerd met IPTG en vervolgens werden blootgesteld aan TCP bijna 90% lager was dan die van gastheercontroles die werden blootgesteld aan geen van beide stoffen (P < 0,01) (Fig. 2b). Dit dramatische verlies van levensvatbaarheid komt niet overeen met een eenvoudige som van de individuele effecten van de twee verbindingen; het is duidelijk dat de iptg de toxiciteit van TCP verergerde. Het feit dat IPTG de toxiciteit van TCP verergerde en niet omgekeerd, werd bevestigd door het Plateren van drie recombinanten die de route van de synthetische biologische afbraak dragen (Fig. 2b). Omdat deze degraders functionele wegen voor TCP degradatie hadden, waren zij beter in staat om zijn aanwezigheid te tolereren. Belangrijk, hoe sneller de omzetting van TCP door de wegenzymen, hoe groter de levensvatbaarheid van de degraders. Deg31opt, dat een snelle eerste omzetting van TCP bereikte maar aanzienlijke hoeveelheden van de tussenproducten DCP en GDL verzamelde, overleefde de 5 uur incubatie bijna evenals de gastheercontrole die niet aan het substraat werd blootgesteld. Deze gegevens zijn consistent met de eerder gerapporteerde resultaten van groeistop tests, die erop wezen dat TCP de meest toxische verbinding in de route is .

beoordeling van de effecten van metabole belasting en substraattoxiciteit door middel van cytometrie met meerdere parameters stroom

Cytometrie met meerdere parameters stroom maakt gelijktijdige bepaling van verscheidene biochemische en fysische variabelen mogelijk onmiddellijk na de monstervoorbereiding en moet derhalve nauwkeuriger informatie opleveren over de fysiologische status van de cellen dan kan worden verkregen door plating . Deze techniek biedt ook zeer belangrijke informatie over de heterogeniteit van bacteriële populaties aan. In tegenstelling tot plating onderschat het niet het aantal levensvatbare cellen in originele culturen in gevallen waarin een fractie van de bevolking subletale schade heeft ervaren en het vermogen om te groeien heeft verloren .

incubatie van de drie storingsorganen en gastheercontroles werd uitgevoerd onder de in de vorige paragraaf genoemde omstandigheden. De monsters die na 5 uur incubatie met of zonder TCP werden genomen, waren gekleurd met propidium jodide (PI), 6-carboxy-2′,7′-dichloordihydrofluoresceïne diacetaat (carboxy-H2DCFDA) of bis-(1,3-dibutylbarbituurzuur) trimethine oxonol . De kleurstoffen voor etikettering van nucleic zuren, zoals PI, die cellen met gecompromitteerde membranen slechts ingaan, worden algemeen gebruikt met membraanpotentiaal-gevoelige kleurstoffen zoals DiBAC4(3), die de lipide-bevattende intracellular componenten bindt, aan studie bacteriële levensvatbaarheid . Carboxy-H2DCFDA is een chemisch verminderde, geacetyleerde en carboxylated vorm van fluoresceïne die vele toepassingen als algemene indicator voor de aanwezigheid van reactieve zuurstofspecies (ROS) in eukaryotic en prokaryotic cellen heeft gevonden . Recente studies over bacterieel gebruik van gechloreerde alifatische koolwaterstoffen suggereren dat dit proces wordt geassocieerd met sterke oxidatieve stress en we veronderstelden dat TCP ook een dergelijke fysiologische reactie zou oproepen . De verzadiging van onverzadigde vetzuren door halogenatie of lipideperoxidatie veroorzaakt veranderingen in membraanvloeiing, resulterend in de ineenstorting van elektronentransportketens en premature elektronenoverdracht aan zuurstof, vergezeld van Ros-vorming, membraanpermeabilisatie, en celdood .

het cytometrieprotocol van de eindpuntstroom dat in onze studie werd aangenomen, was minder gevoelig dan plating bij het aantonen van de last die door plasmiden wordt veroorzaakt (Fig. 2b), misschien omdat de aanwezigheid van heterologe DNA en de constitutieve uitdrukking van selectietellers niet direct eigenschappen veranderden die door cytometry worden gericht maar in plaats daarvan de Algemene energiestatus van de cellen onevenwichtig maakten. Nochtans, was de cytometry benadering van de stroom gebruikend geselecteerde fluorochromes nuttig in het blootstellen van de toxische gevolgen van IPTG en TCP. Er waren geen significante verschillen (p > 0.05) tussen de niet-geïnduceerde gastheercontroles met lege plasmiden, ongeacht hun TCP-blootstellingsstatus, met betrekking tot een van de drie in deze experimenten onderzochte variabelen (membraanpermeabiliteit, ROS-vorming en membraanpotentiaal; zie Fig. 2b). Het percentage cellen dat positief bleek voor DiBAC4(3) nam echter tot drie keer toe in de controlegroep die alleen met IPTG werd behandeld (P < 0,01). Hetzelfde effect werd ook waargenomen in deg31, waarvan de respons op inductie en incubatie met TCP gedetailleerder werd bestudeerd (Fig. 3). De fractie van de bacteriële populatie die positief kleurde met alle drie kleurstoffen nam vele malen toe wanneer voorbehandeling met IPTG werd gecombineerd met blootstelling aan TCP, wat het eerder waargenomen exacerberende effect bevestigt en aangeeft dat de werking van TCP in bacteriële cellen gepaard gaat met uitgebreide Ros-vorming (Fig. 2b, 3). Membraandepolarisatie, Ros-accumulatie en membraanpermeabiliteit werden verminderd in E. coli recombinanten die de synthetische biologische afbraakroute uitdrukken, waarbij de mate van reductie evenredig was met de initiële snelheid van TCP-conversie van de stammen. Interessant is dat de exacerbatie van samengestelde toxiciteit door pre-inductie van de bl21 (DE3) gastheercontrole met IPTG ook werd bevestigd in experimenten met het model toxische verbinding tert-butyl hydroperoxide (TBHP), een organische peroxide en sterke Ros vorming bevorderen oxidatieve agent (aanvullend dossier 1: Fig. S3). Dit suggereert dat beschreven exacerbatie fenomeen niet beperkt moet worden tot ons model toxische chemische TCP.

Membraandepolarisatie en Ros-vorming in vivo zijn dynamische processen. Om hun kinetiek in E. coli degraders te volgen voerden we ook tijd-resolved metingen uit (aanvullend bestand 1: Fig. S4). Het aantal cellen dat door DiBAC4(3) en carboxy-H2DCFDA wordt gekleurd, nam in de loop van de tijd lineair toe in alle stressvolle recombinanten behalve deg31. Interessant, toonde deze degrader een aanvankelijke uitbarsting van DiBAC4(3) en carboxy-h2dcfda fluorescentie maar deze signalen dan plateaued of daalden lichtjes. We gaan ervan uit dat de karakteristieke profielen van DiBAC4(3) en carboxy-H2DCFDA-fluorescentie voor deg31 gekoppeld zijn aan de unieke variant van de synthetische biologische afbraakroute en het overeenkomstige tijdsverloop van TCP-biotransformatie. In tegenstelling tot de andere stammen waren TCP, 2,3-dichloorpropaan-1-ol (DCP) en glycidol (GDL) in relatief hoge concentraties aanwezig in het deg31-reactiemengsel tussen minuten 50 en 100 van de meetperiode. Dit kan synergistische toxiciteit hebben veroorzaakt, die het aantal cellen met gedepolariseerde membranen en verbeterde Ros-vorming verhogen. Dergelijke gezamenlijke effecten zijn gebruikelijk; ze zijn waargenomen voor o .a. organofosfaat pesticiden, fluorosurfactanten en zware metalen. De daaropvolgende bevriezing of matige daling van de intensiteit van de signalen werd toegeschreven aan de parallelle verwijdering van TCP en GDL en de productie van glycerol, waarvan bekend is dat het een efficiënt stressbeschermend middel is in gist-en oplosmiddeltolerante stammen van E. coli .

de variant van de synthetische route in deg31 leek het beste compromis te bieden in termen van het omgaan met toxiciteit terwijl TCP efficiënt wordt omgezet in onschadelijke glycerol en werd daarom geselecteerd voor verder onderzoek.

beoordeling van metabole belasting en substraattoxiciteit door elektronenmicroscopie

metabole belasting en toxiciteit kunnen veranderingen in de morfologie van bacteriële gastheren veroorzaken . Daarom hebben we transmissieelektronenmicroscopie gebruikt om de veranderingen in de morfologie van geïnduceerde en niet-geïnduceerde deg31 cellen na 5 uur incubatie met of zonder 2 mM TCP te bestuderen (Fig. 3). Foto ‘ s van geïnduceerde en niet-geïnduceerde E. coli gastheercontrolecellen met lege plasmiden worden getoond in (aanvullend dossier 1: Fig. S5). De microscopische waarnemingen werden gevolgd door cytometrie van de multi-parameter stroom van deg31 cellen die met PI, carboxy-H2DCFDA, of DiBAC4(3) worden bevlekt.

incubatie van niet-geïnduceerde afbraak met TCP produceerde slechts een klein deel van de dode bacteriële cellen, en de morfologie van op deze wijze behandelde cellen verschilde over het algemeen niet van die van cellen die niet aan het toxische substraat blootstaan (Fig. 3a, b). Het aandeel cellen dat gekleurd werd door carboxy-H2DCFDA en PI nam matig toe, maar er werd geen effect op de membraanpotentiaal waargenomen. Pre-geïnduceerde bacteriën die recombinante proteã nen produceren intensief gevormde zichtbare inclusielichamen en toonden frequente scheiding van het cytoplasmic membraan van het buitenmembraan aan de polen van de cel (Fig. 3c). Aangezien het merendeel van de recombinante eiwitten uit cellysaten oplosbaar was (gegevens niet getoond), geloven wij dat de waargenomen lichamen uit actieve enzymen bestonden.

de combinatie van pre-inductie en incubatie met TCP veroorzaakte de meest uitgesproken morfologische veranderingen en ging gepaard met een aanzienlijke toename van het aantal cellen dat positief kleurde voor PI, carboxy-H2DCFDA en DiBAC4(3) (Fig. 3d). Talrijke dode of stervende cellen met beschadigde cytoplasmatische membranen en gelekte inhoud waren duidelijk zichtbaar. Toch weerstond een aanzienlijk deel van de bevolking de gecombineerde effecten van IPTG en TCP gedurende de behandelingsperiode van 5 uur. Dit was voornamelijk te wijten aan de evenwichtige synthetische route van deg31 en de snelle omzetting van tcp in glycerol. Bistability is een veel voorkomend fenomeen en kan worden toegeschreven aan ruis in de expressie van de multigene eigenschappen verantwoordelijk voor toxiciteitstolerantie en de Graduate stressrespons in de bacteriële populatie . Samengevat, onze microscopische waarnemingen van deg31-populaties die onder vier verschillende omstandigheden werden behandeld, waren consistent met eerdere resultaten en ondersteunden de conclusie dat pre-inductie met IPTG de TCP-toxiciteit verergert.

exacerbatie-effect van toxiciteit stijgt in cellen die metabole belasting ondervinden van plasmiden

aangezien zowel de E. coli-afbraakders als de gastheercontroles die bij dit werk werden gebruikt, de metabole belasting van de Duet-plasmiden en het laciq/P lacUV5-T7-expressiesysteem moesten opvangen, hebben wij besloten de E. coli-controles zonder deze componenten in het volgende experiment op te nemen. Hiervoor gebruikten we E. coli BL21 (DE3) zonder plasmiden en de klonerende stam E. coli DH5a, die zowel het laciq/p lacUV5-T7 expressiesysteem als het lac operon ontbeert. Door gebruik te maken van de plating en stroom cytometry protocollen hierboven beschreven, vonden we dat de exacerbatie effect was bescheiden of volledig afwezig in beide stammen (extra dossier 1: Fig. S6A, B). Dit suggereert dat de dubbele spanning van IPTG en TCP zich alleen manifesteert in stammen die Duet plasmiden en het bijbehorende expressiesysteem dragen.

we gaan ervan uit dat de bestudeerde recombinanten de dubbele belasting van IPTG en het toxische substraat niet efficiënt konden onderdrukken als gevolg van de metabole belasting die door plasmiden wordt opgelegd en het overeenkomstige tekort aan middelen dat nodig is voor celonderhoud. Het schijnt dat de chemische structuur van IPTG, zijn vervoer of aanwezigheid binnen de cel fysiologische veranderingen teweegbrengt die de manifestatie van TCP giftigheid in E. coli BL21(DE3) cellen met Duet plasmiden vergemakkelijken.

vermindering van de metabole belasting en exacerbatie van de toxiciteit door het afstemmen van de iptg-concentratie

vervolgens probeerden we de belasting van E. coli recombinanten te verminderen door de concentratie van IPTG te optimaliseren. We zochten naar de laagst mogelijke concentratie inductor die de fitnesskosten zou minimaliseren zonder de efficiëntie van het systeem bij het verlagen van TCP aanzienlijk in gevaar te brengen. Deg31-cellen werden vooraf geïnduceerd met iptg-concentraties variërend van 0,01 tot 1,00 mM en de resulterende effecten op de levensvatbaarheid van de cellen en de efficiëntie van de route werden bestudeerd (Fig. 4; aanvullend bestand 1: Fig. S7).

E. coli BL21 (DE3) met de lege pETDuet-en PCDF-plasmiden werd gebruikt als controle voor plating om de belasting te bepalen die door IPTG-blootstelling aan de gastheer wordt opgelegd bij afwezigheid van de heterologe route (Fig. 4). De levensvatbaarheid van de pre-geïnduceerde afbraak en controle werd gecontroleerd voor en na 5 uur incubatie in fosfaatbuffer met 2 mM TCP en vergeleken met die van cellen die niet aan IPTG zijn blootgesteld (Fig. 4a, b). Het percentage overlevende cellen na incubatie werd in elk geval berekend (Fig. 4c). Uit deze experimenten bleek dat zelfs bij afwezigheid van TCP er een omgekeerde correlatie was tussen de iptg concentratie en de levensvatbaarheid van de recombinant E. coli (Fig. 4a). De deg31-stam leed meer onder toenemende iptg-concentraties dan de controle, waarschijnlijk als gevolg van de extra belasting van het uitdrukken van genen die coderen voor de synthetische route. Na 5 uur incubatie was het tegendeel het geval, omdat de TCP-kataboliserende deg31 stam beter bestand was tegen verhoogde toxiciteit dan de gastheercontrole (Fig. 4 ter, c). De synthetische pathway stam vertoonde vergelijkbare overlevingspercentages bij alle geteste iptg concentraties behalve voor de hoogste-de relatieve levensvatbaarheid van deg31 vooraf geïnduceerd met 1 mM IPTG was 100%. We gingen ervan uit dat deze perifere waarde te wijten was aan onderschatting van het aantal levensvatbare cellen vóór incubatie als gevolg van de intensieve stress ervaren door de degrader bij inductie met een dergelijke hoge concentratie van IPTG en de resulterende aanwezigheid van levensvatbare-maar-niet-cultureerbare cellen in de suspensie . Plating experimenten toonden aan dat een fractie van de bacteriepopulatie zijn vermogen om te groeien en te reproduceren enige tijd na de behandeling met deze hoge concentratie van IPTG (aanvullend dossier 1: Fig. S8).

de tijdsduur van TCP-biotransformatie met rustcellen van deg31, vooraf geïnduceerd met IPTG bij 1,00, 0,20, 0,05, 0,025 en 0,01 mM (aanvullend dossier 1: Fig. S7) en densitometrische analyse van SDS polyacrylamide gels met de overeenkomstige monsters van celvrije extracten (aanvullend dossier 1: Fig. S9, tabel S1) toonde aan dat: i) de relatieve verhouding tussen pathway-enzymen en de vorm van het afbraakprofiel veranderden niet wezenlijk met de inductorconcentratie, terwijl ii) het gehalte van de drie pathway-enzymen in het totale oplosbare eiwit van de recombinante bacteriën daalde van 55% (1 mM IPTG) tot 32% (0,01 mM IPTG) en de output van de pathway daalde van 70 tot 46 %. Merkbare omzetting van TCP werd ook bereikt met niet-geïnduceerde cellen als gevolg van de lekkage van de T7-promotor en basale expressie van genen binnen de route (aanvullend dossier 1: Fig. S7).

Figuur 5 geeft een samenvatting van de balans van de drie parameters die in de voorgaande paragrafen zijn besproken: I) levensvatbaarheid van de gastheer, ii) de cellulaire expressie van pathway-enzymen en iii) de output van de synthetische biologische afbraakroute. We concluderen dat de minimale iptg concentratie die voldoende expressie van genen binnen de route mogelijk maakt om een redelijke output te bereiken 0,025 mM is. Vergelijkbare inductoren concentraties die volledige genexpressie mogelijk maken zijn gemeld voor enkele recombinante eiwitten zoals β-galactosidase, groen fluorescerend eiwit en rhamnulose-1-fosfaat aldolase . Merk op dat de iptg-concentratie van 0,025 mM acht keer lager is dan de oorspronkelijk geteste inductorconcentratie en tot 40 keer lager dan de waarden die zijn gerapporteerd in de wetenschappelijke literatuur waarin de engineering van heterologe routes in E. coli wordt beschreven . Inductie met lagere hoeveelheden IPTG verbeterde de geschiktheid van de gastheer. Zelfs de laagste concentratie van 0,01 mM verminderde echter de levensvatbaarheid van de E. coli-afbraak met 30% ten opzichte van de niet-geïnduceerde deg31 en met maximaal 50% ten opzichte van de niet-geïnduceerde gastheercontrole (P < 0,05 in beide gevallen; Fig. 4b). Daarom hebben we de mogelijkheden onderzocht om IPTG te vervangen door een alternatieve inductor.

vermindering van de metabole belasting en exacerbatie van de toxiciteit door inductie met lactose

Lactose is een natuurlijke inductor van het lac-operon en kan worden gebruikt als een goedkoper alternatief voor synthetische IPTG. Het is bewezen dat het expressie van recombinante eiwitten in E. coli induceert in dezelfde mate als IPTG op laboratorium-en industriële schaal . In tegenstelling tot IPTG is lactose een substraat van β-galactosidase (gecodeerd door lacZ) en kan het dus worden gemetaboliseerd door cellen met een intact lac-operon, waaronder E. coli BL21(de3). Daarom worden concentraties van lactose tot 30 mM vaak gebruikt om de expressie van gekloonde genen te induceren op niveaus die kunnen worden bereikt met ≤1 mM IPTG .

we onderzochten de pre-inductie van deg31 cellen met 1 mM lactose. We gingen ervan uit dat deze concentratie voldoende zou zijn om de expressie van de TCP-degradatieweggenen te induceren op niveaus die voldoende degradatie-efficiëntie zouden bieden. Deze verwachting werd bevestigd door geregistreerde tijd-kuren van TCP biotransformatie en de bevinding dat pathway enzymen goed voor 41% van de totale oplosbare eiwitten van de cellen onder deze omstandigheden (aanvullend dossier 1: vijgen. S7 en S9, en tabel S1). De theoretische omzetting van tcp in glycerol onder deze omstandigheden was 63 %. Deze waarden liggen dicht bij de waarden die zijn waargenomen voor deg31-cellen die vooraf zijn geïnduceerd met 0,025 of 0,05 mM IPTG. Het belangrijkste is dat de met lactose geïnduceerde deg31-cellen vóór en na 5 uur incubatie met TCP een hogere levensvatbaarheid vertoonden dan met IPTG behandelde bacteriën bij een van de geteste concentraties (P < 0,05; Fig. 4). Hetzelfde verlichtende effect werd waargenomen voor de gastheercontrole. In termijn van overleving, pre-geïnduceerde cellen met lactose presteerden bijna net zo goed als hun niet-geïnduceerde tegenhangers (Fig. 4c). In overeenstemming met de plating resultaten, flow cytometrische analyse van gastheer controle en deg31 cellen pre-geïnduceerd met lactose toonde significant lagere niveaus van stress cellen met gedepolariseerde membranen dan werden waargenomen voor E. coli stammen pre-geïnduceerd met IPTG (P < 0,01; aanvullend dossier 1: Fig. S10). Deze resultaten gaven opnieuw aan dat de werking van iptg in de bestudeerde recombinanten consistent gepaard ging met veranderingen in membraaneigenschappen.

een hogere levensvatbaarheid van cellen geïnduceerd met lactose in plaats van IPTG werd eerder gemeld voor de expressie van enkelvoudige heterologe eiwitten . Dit effect werd toegeschreven aan de vertraagde, mildere inductie die werd bereikt met de natuurlijke inductor. In tegenstelling tot synthetische IPTG, die de cel snel zowel door passieve verspreiding als met behulp van LacY lactose permease kan ingaan, kan de lactose slechts het cytoplasma via de permease ingaan. Bovendien moet lactose Door β-galactosidase worden omgezet in allolactose voordat het zich bindt aan de Lac-onderdrukker, terwijl IPTG zich rechtstreeks aan de onderdrukker bindt. Onze resultaten bevestigen dat lactose een lagere metabole belasting oplegt dan IPTG, wat suggereert dat het ook een geschiktere inductor is voor de expressie van volledige heterologe routes in E. coli BL21(de3). Dit is vooral belangrijk voor E. coli BL21 (DE3) cellen die synthetische routes dragen die toxische verbindingen afbreken of giftige tussenproducten produceren.