Gelfiltratiechromatografie

toepassingen voor Gelfiltratiechromatografie

Gelfiltratiechromatografie, een soort grootteuitsluitingschromatografie, kan worden gebruikt om moleculen en complexen in een monster te fractioneren tot fracties met een bepaald groottebereik, om alle moleculen groter dan een bepaalde grootte uit het monster te verwijderen, of een combinatie van beide bewerkingen. De chromatografie van de gelfiltratie kan aan afzonderlijke samenstellingen zoals kleine molecules, proteã nen, eiwitcomplexen, polysacchariden, en nucleic zuren worden gebruikt wanneer in waterige oplossing. Wanneer een organisch oplosmiddel als mobiele fase wordt gebruikt, wordt het proces in plaats daarvan aangeduid als de chromatografie van de gelpermeatie.

Gelfiltratiechromatografie kan ook worden gebruikt voor:

• Fractionering van moleculen en complexen binnen een vooraf vastgestelde grootte bereik
• Grootte analyse en bepaling
• Verwijdering van grote eiwitten en complexen
• Buffer exchange
• Desalting
• Verwijderen van kleine moleculen zoals nucleotiden, primers, verven, en verontreinigingen
• Beoordeling van het monster zuiverheid
• Scheiding van gebonden van ongebonden radio-isotopen

Gel filtratie chromatografie media voor alle bovenstaande toepassingen zijn beschikbaar in voorverpakte de zwaartekracht flow kolommen, spin kolommen, lage-druk-en kolommen voor middelhoge drukchromatografie en harsen in flessen.

mechanisme voor Gelfiltratiechromatografie

in een kolom voor gelfiltratiechromatografie bestaat de stationaire fase uit een poreuze matrix en is de mobiele fase de buffer die tussen de matrixparels stroomt. De parels hebben een gedefinieerde poriegrootte, bekend als de fractioneringswaaier. Molecules en complexen die te groot zijn om de poriën binnen te gaan blijven in de mobiele fase en zich door de kolom met de stroom van de buffer bewegen. De kleinere molecules en complexen die zich in de poriën kunnen bewegen gaan de stationaire fase in en bewegen door de kolom van de gelfiltratie door een langere weg door poriën van de parels.

elk molecuul of complex dat boven het fractioneringsbereik voor een bepaalde kolom van gel filtration chromatography ligt, beweegt zich sneller door de kolom dan elk molecuul dat de stationaire fase kan ingaan. Daarom zal elk bestanddeel in het monster dat zich boven het fractioneringsbereik bevindt, eerst elueren (in het lege volume) voordat iets dat zich binnen het fractioneringsbereik bevindt. De minimale grootte die in de mobiele fase blijft en niet in de stationaire fase komt, staat bekend als de uitsluitingslimiet. Bio-Rad biedt gel filtratie chromatografie media en kolommen met uitsluitingslimieten variërend over drie ordes van grootte, van 100 Dalton tot 100.000 Dalton (100 kDa).

moleculen en complexen die in de stationaire fase kunnen komen, worden gefractioneerd volgens hun grootte. De kleinere molecules zullen diep in de poriën migreren en zullen meer dan Grotere molecules worden vertraagd die niet zo gemakkelijk de poriën ingaan, en zo sneller van de kolom worden uitgeweken. Dit verschil in poriemigratie leidt tot fractionering van componenten door grootte met het grootste eluting eerst.

in kolommen voor gelfiltratiechromatografie, ontworpen voor ontzouting, bufferuitwisseling en het verwijderen van kleine moleculen zoals nucleotiden, komen de zouten en kleine verbindingen gemakkelijk in de poriën terecht, worden zij vertraagd en migreren zij langzamer door de kolom dan de grotere eiwitten of nucleïnezuren. Daarom worden de componenten van belang in de steekproef vooraf van zouten, nucleotiden, enz.geëlueerd. DNA cleanup kits met behulp van dit mechanisme bevatten vaak gel filtratie spin kolommen.

resolutie, hier gedefinieerd als de scherpte van de grenzen tussen groottefracties, wordt bepaald door de grootte van de kralen en een aantal andere factoren. De kleinere parelgrootte brengt over het algemeen hogere resolutie in een kolom van de de chromatografie van de gelfiltratie op. De compacte molecules verspreiden door de stationaire fase sneller dan lineaire molecules. Grootteuitsluiting, fractioneringswaaier, en elutietarief worden beà nvloed door buffersamenstelling, Ionische sterkte, en pH. voor de fractionering van complexe mengsels van proteã nen, kunnen de elutietijden en de grootteuitsluitingslimieten empirisch moeten worden bepaald.

Media voor Gelfiltratiechromatografie

een belangrijk criterium voor media voor gelfiltratiechromatografie is dat media inert zijn en dat niets in het monster of enige buffer zich aan de media bindt. Een andere overweging is het type van de kolom van de gelfiltratie die wordt gebruikt en of het in een onder druk geplaatst chromatografiesysteem of zwaartekrachtstroom of spinkolommen wordt gebruikt. Als een onder druk geplaatst chromatografiesysteem wordt gebruikt, moeten zowel de kolom als de media de gebruikte druk en stroomsnelheden kunnen verdragen.

veelgebruikte media voor gelfiltratiechromatografie zijn gebaseerd op agarose-of polyacrylamideparels, dextrose voor zwaartekracht-of lagedruksystemen en polymere harsen voor middelhogedruksystemen. De keuze van de media is afhankelijk van de eigenschappen van de te scheiden componenten en andere experimentele factoren. Het volgende zijn algemene overwegingen bij het bepalen van de keuze van de chromatografiemedia van de gelfiltratie:

• Fractionering bereik
• Grootte uitsluiting limiet
• werkdruk
• Debiet
• Voorbeeld viscositeit
• pH-bereik
• Autoclavability
• Tolerantie voor water mengbaar organische oplosmiddelen; sommige monsters kunnen beter oplosbaar in water-organische mix
• Tolerantie voor wasmiddelen, chaotropic agenten, formamide, enz.
• Bedrijfstemperatuur

de soorten monsters, de keuze van de media en de opstelling van het chromatografiesysteem bepalen welke parameters het belangrijkst zijn voor een bepaalde zuiveringstoepassing.