resultaten en discussie
PCR-RFLP analyse onthulde restrictiepatronen die compatibel zijn met de silico analyse. Alle honden met staartafwijkingen vertoonden hetzelfde patroon (3 fragmenten, 2 zichtbare banden), dat anders was dan honden met een normale staart (2 fragmenten, 1 zichtbare band) (Fig.1). Een andere test, ook gebaseerd op PCR-RFLP, werd met succes gebruikt om dezelfde mutatie in het T-gen van honden te identificeren, maar met behulp van een polyacrylamidegelelektroforesesysteem (Gruszczynska & Czapla 2011). De prestaties van de polyacrylamidegelelektroforese konden de resolutie van banden met betrekking tot fragmenten van DNA in de huidige studie verbeteren. De uitvoerbaarheid zou echter worden verminderd, omdat dit systeem omslachtiger is. In de huidige studie, hoewel het niet mogelijk was om alle fragmenten van DNA te visualiseren die na spijsvertering worden gegenereerd, was het mogelijk om genotypes gemakkelijk te onderscheiden gebruikend agarosegelelektroforese.
Fig.1. PCR-RFLP voor detectie van c189g-mutatie. Marker van basisparen (M), aangetaste honden – korte staart (1-7) en dier met normale staart (8).
bij de analyse van gesequenced monsters werd heterozygositeit C (cytosine) G (guanine) alleen waargenomen in nucleotide 189 van exon 1 bij honden met staartafwijkingen. De locatie van de mutatie was gebaseerd op de t-gen mRNA-sequentie die beschikbaar is in de Genbank (Toelatingsnummer: AJ245513).
bij de in silico-analyse werd ook een verandering van aminozuur 63 van isoleucine naar methionine waargenomen. Alle DNA-sequenties die in dit onderzoek zijn verkregen, werden in Genbank gedeponeerd onder de toetredingsnummers: MF495488 (korte staart), mf495489 (afwezigheid van staart), MF495490 (afwezigheid van staart) en mf495491 (normale staart).
hoewel voor de huidige aandoening slechts één genotype werd gevonden (CG voor dieren met staartmisvorming), werd bij de getroffen honden een fenotypische variatie waargenomen, namelijk de grootte van de staart. Sommige dieren presenteerden korte staart (ongeveer 3-4 wervels), en anderen vertoonden afwezigheid van staart (ongeveer 1-2 wervels) (Fig.2). Vergelijkbare fenotypen werden ook waargenomen door Haworth et al. (2001) bij honden. Hoewel een verklaring voor dit is nog niet bekend bij honden, Buckingham et al. ( 2013), het bestuderen van aangeboren staartgrootte variatie in katten, vond bewijs van haploinsufficižntie veroorzaakt door meerdere mutaties in het T-gen. Mutaties van C. 1199delC, C. 1169delC en c. 998delT werden geassocieerd met verschillende niveaus van genexpressie, wat de verschillende fenotypen bij honden met staartafwijkingen kon verklaren (Buckingham et al. 2013).
Fig.2. (A) hond die mutatie C189G in het T-gen draagt. B) hond uit hetzelfde nest zonder c189g mutatie.
het erfelijke karakter van de mutatie kan worden aangetoond door de erfgramanalyse (Fig.3)van het onderzochte nest. Het was mogelijk om te verifiëren dat de mutatie een autosomaal dominant overerving patroon heeft. Er werd echter geen dominant homozygote (GG) genotype gevonden in deze studie, wat de waarnemingen versterkt dat wanneer bij homozygose, het gemuteerde t gen foetale dood veroorzaakt (Haworth et al. 2001). Hytonen et al. (2009) waargenomen dat nesten van kruisingen tussen dieren met normale staart (CC genotype) waren 29% groter dan nesten van kruising tussen misvormde staartdieren (CG genotype). Dit resultaat is verenigbaar met de verwachte afname van 25% bij nakomelingen van kruisingen waarbij letale allelen betrokken zijn.
Fig.3. Erfogram dat het overerving patroon toont van de c189g mutatie in het T gen van Labrador Retriever. Kruising tussen grootouders van moeders (I), nest van de getroffen hond en de kruising met normale reu (II) en geanalyseerd nest (III).
mutaties in het T-gen zijn in verband gebracht met staartafwijkingen bij andere soorten zoals muizen en katten (Wilson et al. 1995, Buckingham et al. 2013). En in sommige van hen worden ook andere veranderingen waargenomen, zoals urine-en fecale incontinentie bij katten (Robinson 1993). Echter, bij honden, tot op heden, alleen staart misvorming is waargenomen bij heterozygote dieren (CG) (Indrebo et al. 2008). Hoewel in sommige honden rassen de” staart misvorming ” fenotype was niet geassocieerd met de c189g mutatie (Boston Terrier, Engels Bulldog, King Charles Spaniel, miniatuur Schnauzer, Parson Russell Terrier, en Rottweiler), het grote aantal rassen beïnvloed suggereert een oude mutatie (Hytonen et al. 2009), aanwezig in voorouderlijke honden vóór de vorming van vele rassen. Interraciale kruising kan echter ook hebben bijgedragen aan de mutatiediffusie, aangezien CG heterozygote dieren geen libido of reproductieve prestatieveranderingen lijken te hebben. Een andere factor die kan hebben bijgedragen aan de mutatiediffusie was het gebruik bij de voortplanting van honden zonder staart, toen esthetische caudectomie nog toegestaan was. In deze periode, is het waarschijnlijk dat veel dieren met staart agenesis zijn gebruikt als reproduceerders, aangezien de afwezigheid van de staart was wenselijk in sommige rassen, die bijdragen aan de mutatie diffusie.
momenteel is de praktijk van caudectomie (chirurgische staartverwijdering) een verboden procedure in verschillende landen van de wereld, zoals die van de Europese Unie en Brazilië (Haworth et al. 2001, CFMV 2013). In sommige landen van de Europese Unie worden genetische tests gebruikt om de c189g-mutatie in het T-gen te identificeren om na te gaan of de afwezigheid van staart in sommige rassen van aangeboren oorsprong is of dat de dieren een onregelmatige chirurgische ingreep hebben ondergaan. PCR-RFLP gebruikt in deze studie was een eenvoudige en nauwkeurige techniek om deze mutatie te identificeren en kon worden gebruikt als bewijs om illegale caudectomie praktijk te identificeren.
vanwege de schaarste aan informatie over de c189g-mutatie in het T-gen van honden, is er geen verdere informatie over de associatie met andere morfologische of zelfs fysiologische karakters en moet daarom worden onderzocht.