een soortgelijke genetische code wordt gebruikt door de meeste organismen op aarde, maar verschillende organismen hebben verschillende voorkeuren voor de codon die ze gebruiken om specifieke aminozuren te coderen. Dit is mogelijk omdat er 4 basen (A, T, C, en G) en 3 posities in elk codon. Er zijn daarom 64 codons mogelijk maar slechts 20 aminozuren en 3 stop codons om te coderen waardoor 41 codons vermist worden. Het resultaat is redundantie; meerdere codons coderen enkele aminozuren. Evolutionaire beperkingen hebben gevormd welke codons bij voorkeur worden gebruikt in welke organismen-organismen hebben codon gebruik bias.
u kunt vele codontabellen vinden die laten zien welke codon welke aminozuren coderen (zie voorbeeld rechts). Met dergelijke eenvoudige regels, zou u kunnen denken het gemakkelijk is om met een werkbare opeenvolging van DNA op de proppen te komen om uw peptide van belang te coderen en dat peptide in uw organisme van keus te veroorzaken. Helaas, codon Voorkeuren maken het zodat u niet kunt kiezen tussen de mogelijke codons op willekeurige en verwachten dat uw sequentie goed uit te drukken in elk organisme.
wat zijn de evolutionaire beperkingen die tot deze voorkeuren leiden en wat kunnen we daaraan doen? Lees verder om erachter te komen!
Waarom hebben organismen een verschillend gebruik van codon?
de redenen voor uiteenlopende codonvoorkeuren onder organismen zijn niet volledig begrepen, maar enkele mogelijke redenen zijn::
- metabolische druk-het vergt cellulaire middelen om tRNAs te produceren die verschillende codons erkennen, tRNAs correct wijzigen, en trnas met de aangewezen aminozuren Laden. Als een organisme slechts een deelverzameling van codons gebruikt, hoeft het slechts een deelverzameling van geladen tRNAs te produceren en kan het daarom minder middelen nodig hebben voor het gehele vertaalproces. Bijvoorbeeld, tijdens de voorwaarden van het hoge groeisnelheid, upreguleert E. coli bij voorkeur de productie van tRNAs die codons in hoogst tot expressie gebrachte genen herkennen (Emilsson en Kurland, 1990).
- controle van genexpressie door middel van gensequentie – eiwitten die worden gecodeerd door codon met een lage abundantie of slecht geladen tRNAs kunnen met een lagere snelheid worden geproduceerd dan eiwitten die worden gecodeerd door zeer overvloedige, geladen tRNAs. Bijvoorbeeld Tuller et al. gevonden dat de vertaalefficiëntie goed gecorreleerd is met codon bias in zowel E. coli als S. cerevisiae.
- eiwitvouwen-als een eiwit wordt gecodeerd door een mengsel van codonen met sterk en slecht geladen tRNAs, kunnen verschillende regio ‘ s van het eiwit met verschillende snelheden worden vertaald. Het ribosoom zal zich snel langs gebieden bewegen die om overvloedige, geladen tRNAs roepen maar zal op gebieden die om lage overvloed, slecht geladen tRNAs roepen kraamen. Wanneer het ribosoom kraamt, kan dit de snel vertaalde gebieden een kans geven om behoorlijk te vouwen. Pechmann en Frydman vonden bijvoorbeeld dat stukken van niet-optimale codon geassocieerd zijn met specifieke secundaire structuren in 10 nauw verwante giststammen.
- aanpassing aan veranderende omstandigheden – organismen moeten genen vaak op verschillende niveaus onder verschillende omstandigheden tot expressie brengen. Met gevarieerd codongebruik, kan een organisme veranderen welke proteã nen hoogst worden uitgedrukt en die slecht worden uitgedrukt door specifieke tRNA-pools te produceren en te laden. Bijvoorbeeld, tRNAs gebruikt in genen coderen aminozuur biosynthetische enzymen kan bij voorkeur worden geladen tijdens aminozuur verhongering waardoor in hogere productie van aminozuur biosynthetische enzymen (Dittmar et al., 2005).
hoe beïnvloedt codon gebruik bias mijn experimenten?
hoewel codonvoorkeuren zeer nuttig kunnen zijn voor organismen, kunnen ze problematisch zijn voor onderzoekers die proberen eiwitten in heterologe gastheren tot expressie te brengen. Als je bijvoorbeeld gewoon een gen van belang uit het menselijk genoom versterkt, kan het helemaal niet tot expressie komen in E. coli (je kunt een verscheidenheid aan databases vinden die de codonvoorkeuren van verschillende organismen online tonen). Zelfs als het gen wordt vertaald, kan het niet goed functioneren. Dit is het gevolg van een mismatch tussen menselijke en E. coli codon voorkeur. Sommige codons algemeen gebruikt in mensen zijn helemaal niet gemeenschappelijk in E. coli en vice versa. Wanneer het vertalen van deze codon, kan het ribosoom daarom stal bij ongeschikte plaatsen of er niet in slagen om het door het volledige transcript te maken resulterend in de productie van niet-functionele proteã NEN EN eiwitfragmenten respectievelijk.
het oplossen van het probleem van codongebruik bias – codonoptimalisatie en de expressie van alternatieve tRNAs
codonoptimalisatie
met goedkope DNA-synthese is een van de belangrijkste manieren waarop onderzoekers het probleem van codonkeuze oplossen, het resynthetiseren van genen op een zodanige manier dat hun codons meer geschikt zijn voor de gewenste expressiehost. Dit staat bekend als “codon optimalisatie.”Hoewel eenvoudig in theorie, dit is niet zo eenvoudig als het klinkt. Zelfs voor vrij korte peptides, kunnen er vele mogelijke manieren zijn om hen te coderen en wat het “aangewezen” codon vormt is niet noodzakelijk duidelijk.
je zou kunnen denken, ” onzin! Ik zou gewoon het codon met de meest voorkomende pool van geladen tRNAs in mijn gastorganisme moeten kiezen voor elk aminozuur dat ik zou willen coderen,” maar, zoals hierboven beschreven, hoeft niet elke regio van een eiwit noodzakelijkerwijs snel te worden vertaald om een eiwit te produceren dat goed functioneert.
je zou dan kunnen denken, ” Oké, ik zal er gewoon voor zorgen dat de abundanties van de codons die ik kies voor de gastheer overeenkomen met de abundanties van codons die gebruikt worden in het inheemse organisme.”Dit is mogelijk een beter idee en is met succes gebruikt in het verleden (Angov et al., 2008), maar er zijn nog veel meer functies te overwegen bij het ontwerpen van een volledig gen. Een niet-uitputtende lijst bevat::
- Codon overvloed in vergelijking met cognate tRNA overvloed
- Repetitieve sequenties
- Beperking sites
- Sequenties gevoelig te maken van secundaire structuren in RNA transcripten
- Effecten op de transcriptie (vergeet niet, het is niet alles over de vertaling – bijvoorbeeld codon keuze kan onderbreken van de transcriptie factor binding sites)
Zoals je je kunt voorstellen, het is niet makkelijk voor mensen om de balans van al deze factoren op hun eigen. Gelukkig hebben veel onderzoekers codon optimalisatie algoritmen en DNA-synthese bedrijven zoals IDT en GenScript host Online codon optimalisatie tools gemaakt. Houd in gedachten dat, alleen omdat je een gen optimaliseert met een van deze tools, het niet per se betekent dat het gen gaat goed uit te drukken. Als u goede uitdrukking krijgt, zou u ook functioneel de geproduceerde proteã ne moeten analyseren om ervoor te zorgen dat het behoorlijk heeft gevouwen.
u kunt voorkomen dat uw genen voor codon geoptimaliseerd worden door plasmiden te bestellen die ze bevatten uit Addgene. Als een plasmide bij Addgene een gen bevat dat is geoptimaliseerd voor codon voor een bepaald organisme, zal dit soms (maar niet altijd) worden genoteerd in het veld “mutatie” op de plasmide pagina (zie plasmide 87904 bijvoorbeeld). Aangezien veel plasmiden die beschikbaar zijn bij Addgene nu volledige sequentiegegevens hebben, raden wij aan om gensequenties direct te analyseren voor codonoptimalisatie en geschiktheid voor uw expressiehost voordat u ze gebruikt in uw experimenten.
expressie van alternatieve tRNAs
Als u niet de tijd of de middelen hebt om een codon geoptimaliseerde versie van uw gen te synthetiseren, is het mogelijk om lage abundantie tRNAs in uw expressiehost overexpressie te geven en zo hun abundantie te verhogen. Bijvoorbeeld, drukken de commerciële Rosetta E. coli spanningen een verscheidenheid van tRNAs uit die normaal bij lage overvloed in E. coli worden gevonden.
het voordeel van het produceren van extra tRNAs is dat je hetzelfde expressiesysteem voor veel verschillende genen kunt gebruiken zonder nieuwe constructies te hoeven maken. Nochtans, wegens problemen zoals mismatched vertalingstarieven en potentiële gevolgen voor celgroei, kunnen zelfs gastheren die alternatieve tRNAs produceren niet voldoende hoeveelheden van uw proteã ne van belang uitdrukken.
ongeacht welke methode u kiest om de problemen rond codonkeuze te overwinnen, moet u een methode hebben om ervoor te zorgen dat de eiwitten die u produceert goed functioneren. Overexpressie kan in de productie van onoplosbare, niet-functionele klodders van proteã ne resulteren die als inclusieorganen worden bekend die over het algemeen met de celpellet tijdens zuiveringsprocedures zullen scheiden. Zelfs als u een grote hoeveelheid proteã ne in uw uitdrukkingsgastheer van keus produceert, zou u een functionele analyse moeten uitvoeren om ervoor te zorgen uw proteã ne geen inclusielichamen vormt en behoorlijk vouwt.
1. Angov, Evelina, et al. “De heterologe eiwituitdrukking wordt verbeterd door de frequenties van het codongebruik van het doelgen met die van de uitdrukkingsgastheer te harmoniseren.”PloS one 3.5 (2008): e2189. PubMed PMID: 18478103. PubMed Central Pmcid: PMC2364656.
2. Dittmar, Kimberly A., et al. “Selectief opladen van tRNA isoacceptoren veroorzaakt door aminozuur verhongering.”EMBO reports 6.2 (2005): 151-157. PubMed PMID: 15678157. PubMed Central Pmcid: PMC1299251.
3. Emilsson, Valur en Charles G. Kurland. “Groeisnelheid afhankelijkheid van overdracht RNA abundantie in Escherichia coli.”The EMBO journal 9.13 (1990): 4359-4366. PubMed PMID: 2265611. PubMed Central Pmcid: PMC552224.
4. Gustafsson, Claes, Sridhar Govindarajan en Jeremy Minshull. “Codon bias and heterologe protein expression.”Trends in biotechnology 22.7 (2004): 346-353. PubMed PMID: 15245907.
5. Maertens, Barbara, et al. “Gene optimization mechanisms: een multi-gen studie onthult een hoog succespercentage van full-length menselijke eiwitten uitgedrukt in Escherichia coli.”Protein Science 19.7 (2010): 1312-1326. PubMed PMID: 20506237. PubMed Central Pmcid: PMC2970903.
6. Pechmann, Sebastian en Judith Frydman. “Evolutionaire behoud van codon optimaliteit onthult verborgen kenmerken van cotranslational vouwen.”Nature structural & molecular biology20.2 (2013): 237. PubMed PMID: 23262490. PubMed Central Pmcid: PMC3565066.
7. Quax, Tessa EF, et al. “Codon bias als een middel om genexpressie te verfijnen.”Molecular cell 59.2 (2015): 149-161. PubMed PMID: 26186290. PubMed Central Pmcid: PMC4794256.
- deze recensie geeft een goed overzicht van codon gebruik bias
8. Tuller, Tamir, et al. “De vertaalefficiëntie wordt bepaald door zowel codonbias als vouwenergie.”Proceedings of the National Academy of Sciences 107.8 (2010): 3645-3650. PubMed PMID: 20133581. PubMed Central Pmcid: PMC2840511.