om een radio-immunoassay uit te voeren, wordt een bekende hoeveelheid van een antigeen radioactief gemaakt, vaak door het te etiketteren met gamma-radioactieve isotopen van jodium, zoals 125-I, gehecht aan tyrosine. Dit radioactief gelabelde antigeen wordt dan gemengd met een bekende hoeveelheid antilichaam voor dat antigeen, en dientengevolge, binden twee specifiek aan elkaar. Vervolgens wordt een serummonster van een patiënt met een onbekende hoeveelheid van hetzelfde antigeen toegevoegd. Dit veroorzaakt het niet gelabelde (of” koude”) antigeen van het serum om met het radioactief gelabelde antigeen (“heet”) voor plaatsen van de antilichaambinding te concurreren. Aangezien de concentratie van “koude” antigeen wordt verhoogd, bindt meer van het aan het antilichaam, het verplaatsen van de radioactief gelabelde variant, en het verminderen van de verhouding van antilichaam-gebonden radioactief gelabeld antigeen aan vrij radioactief gelabeld antigeen. De gebonden antigenen worden vervolgens gescheiden en de radioactiviteit van het vrije(ongebonden) antigeen dat in het supernatans achterblijft, wordt gemeten met behulp van een gamma-teller.
deze methode kan in principe voor elk biologisch molecuul worden gebruikt en is niet beperkt tot serumantigenen en is evenmin vereist dat de indirecte methode wordt gebruikt om het vrije antigeen te meten in plaats van het gevangen antigeen rechtstreeks te meten. Bijvoorbeeld, als het ongewenst of niet mogelijk is om het antigeen of doelmolecule van belang te radiolabelen, kan RIA worden gedaan als twee verschillende antilichamen die het doel erkennen beschikbaar zijn en het doel groot genoeg is (b.v., een proteã ne) om veelvoudige epitopes aan de antilichamen voor te stellen. Een antilichaam zou worden radioactief gelabeld zoals hierboven, terwijl de andere ongewijzigd zou blijven. RIA zou met het” koude ” unlabeled antilichaam beginnen die worden toegestaan om in wisselwerking te staan en aan de doelmolecule in oplossing te binden. Bij voorkeur, wordt dit unlabled antilichaam geïmmobiliseerd op één of andere manier, zoals gekoppeld aan een agarose parel, met een laag bedekt aan een oppervlakte, enz. Vervolgens wordt het” hete ” radioactief gelabelde antilichaam toegestaan om met het eerste complexe antilichaam-doelmolecuul in wisselwerking te staan. Na uitgebreid wassen, wordt de directe hoeveelheid gebonden radioactief antilichaam gemeten en de hoeveelheid doelmolecuul gekwantificeerd door het te vergelijken met een referentiehoeveelheid die tegelijkertijd wordt geanalyseerd. Deze methode is in principe vergelijkbaar met de niet-radioactieve sandwich ELISA-methode.