The Embryo Project Encyclopedia

de Guthrie test, ook wel de PKU-test genoemd, is een diagnostisch hulpmiddel voor het testen van zuigelingen voor fenylketonurie enkele dagen na de geboorte. Om de Guthrie-test toe te dienen, gebruiken artsen Guthrie-kaarten om capillair bloed van de hiel van een kind te verzamelen, en de kaarten worden bewaard voor latere tests. RobertGuthrie vond de test uit in 1962 in Buffalo, New York. Phenylketonuria (PKU) is een aangeboren afwijking waarbij toxische niveaus van theaminozuur fenylalanine zich opbouwen in het bloed, een proces dat de hersenen beà nvloedt bij onbehandelde zuigelingen. Guthrie ‘ s test detecteert fenylalanine in het bloed van pasgeborenen, waardoor een vroege diagnose van PKU mogelijk is. Earlydiagnose van PKU voorkomen dat de ontwikkeling van mentale handicaps in dehousands van personen die elk jaar worden getroffen.

PKU is een erfelijke metabole ziekte waarbij het lichaam niet de enzymefenylalaninehydroxylase aanmaakt. Fenylalaninehydroxylase breekt hetminozuur fenylalanine in het bloed af. Individuen met PKU kunnen hoge concentraties van het aminozuur fenylalanine niet bereiken. Hoge concentraties fenylalanine zijn aanwezig in eiwitrijk voedsel, zoals vlees en vis, evenals in de zoetstof aspartaam. Wanneer individuen met PKU er niet in slagen om fenylalanine in voedsel te verteren, hopen zich hoge niveaus van fenylalanine op in het bloed, veroorzakend hersenschade. Daarom moeten personen met PKU een zeer beperkt dieet eten om te voorkomen dat zij levensmiddelen met hoge concentraties fenylalanine innemen. Onbehandelde PKU kan leiden tot mentale beperkingen, hersenbeschadiging en epileptische aanvallen. PKU treft ongeveer een op de 15.000 mensen inde vs per jaar.

voordat de Guthrie-test werd uitgevoerd, testte de arts zuigelingen op PKU met een minder betrouwbare urinetest van ijzerchloride.De urinetest met ijzerchloride heeft de aanwezigheid van fenolen,waaronder fenylpyruvaat, in de urine aangetoond. De aanwezigheid van het fenolfenylpyruvaat in de urine wees erop dat het individu niet in staat was fenylalanine te verteren omdat fenylpyruvaat een derivaat van fenylalanine is.Om een ijzerchloride urine test uit te voeren, een arts opgelost een urinemonster in een oplossing van water, ethanol, en een paar druppels ijzerchloride. Als phenylpyruvate in de steekproef aanwezig was, vormde het eencomplex met ijzerchloride en produceerde een intense blauw-groene kleur, die erop wijst dat de patiënt PKU had. Artsen merkten verschillende problemen op met de urinetest van ijzerchloride, onder meer dat het niet tot een positief testresultaat leidde met fenylalaninespiegels onder de 20 milligram per 100 milliliter. Zo ‘ n test had een beperkte gevoeligheid en practici konden gemakkelijk lagere concentraties fenylalaninespiegels missen bij personen met PKU. Dientengevolge, worstelt artsen om die individuen met PKU te diagnosticeren en te behandelen wiens urinemonsters lage niveaus van fenylalanine bevatten, leidend tot onomkeerbare hersenbeschadigingen. Veel zuigelingen die met de urinetest van ijzerchloride werden getest, slaagden er niet in om in de eerste zes tot acht weken na de geboorte positief op PKU te testen.Er zijn echter aanwijzingen dat de fenylalaninespiegels in het bloed in de eerste levensdagen snel stijgen, wat in die periode mogelijk toneurologische schade kan veroorzaken. Door de onnauwkeurigheid van de urinetest met ijzerchloride werden veel zuigelingen met PKU niet gediagnosticeerd en ontwikkelden ze symptomen die hun hele leven bleven aanhouden.In 1957 vroeg arts Robert Warner van het Children ‘ s Rehabilitation Center in Buffalo,New York aan Guthrie om een betrouwbaardere en snellere methode voor het opsporen van PKU te ontwikkelen dan die welke op dat moment beschikbaar was. Warner wist van Guthrie ‘ s PKU onderzoek door hun gezamenlijke banden met deerie County National Association of Retarded Children in Buffalo. Heasked Guthrie om een handigere manier om te testen voor PKU te creëren omdat op het moment, om een positieve ijzerchloride-test te bevestigen, artsen vijftig tot twintig kubieke centimeter (cc) veneus bloed naar een testsite in Californië moesten sturen om elke patiënt te testen. Laboranten op de testlocatie voerden vervolgens een bloedtest uit om de aanwezigheid van hoge niveaus van fenylalanine in het bloed te bevestigen of te bevestigen. Guthrie ontwikkelde een nieuwe test voor Warner een paar dagen na het eerste verzoek. De test Guthriedeveloped gebruikte een bacteriële inhibitietest om fenylalanine te ontdekken.

bacteriële inhibitietesten zijn tests waarbij wetenschappers bacteriato gebruiken om de concentratie van een stof in een monster te meten.β-2-Thienylalanine, een aminozuur, remt de groei van de bacteriaBacillus subtilis. Guthrie vond dat fenylalanine, een chemische stof in het bloed van mensen met PKU, de remming van β-2-Thienylalanine van de groei van B. subtilis omkeerde. Dus, om een PKU remming bacterialassay voeren, Guthrie gecoat een gel gebruikt om bacteriën te kweken metß-2-Thienylalanine. Guthrie plaatste bloedmonsters, gedroogd op dik filterpapier, op die gel. Als het bloedmonster fenylalanine bevatte, groeide B. subtilis rond het bloedmonster en gaf aan dat de patiënt PKU had. Als het bloedmonster geenfenylalanine bevatte, groeide B. subtilis niet rond het bloedmonster,wat aangeeft dat de patiënt geen PKU had. Guthrie merkte op dat één technicus één tot 200 bloedmonsters in één enkele dag kon testen en dat elke test slechts een vingerprik van capillair bloed op een filterpapier schijf vereiste.Na het ontwikkelen van de test en het aan Warner te hebben laten zien,testte Guthrie de gevoeligheid van zijn bacteriële inhibitietest met behulp van normale bloedmonsters met fenylalanine. Gevoeligheid is de mogelijkheid van een test om alle gevallen waar de ziekte aanwezig is op te sporen.Guthrie voegde 2, 4, 8, 12 en 20 milligram L-fenylalanine per 100milligram bloedserum toe aan normale bloedmonsters om de phenylalaninespiegels na te bootsen die bij patiënten met PKU werden gevonden. Hij incubeerde die verdroogde bloedmonsters met de toegevoegde L-fenylalanine ‘ s nachts op de bacteriële inhibitie assays en vond dat bacteriën rond de papieren schijven waren gegroeid. Hij bepaalde dat de bacteriegroei in de steekproeven die 12 en 20 milligram fenylalanine per 100 milligram serum bevatten, betekenend dat die steekproeven wezen op een individu mogelijk hadPKU en verder bloedonderzoek zou moeten ondergaan.Na een evaluatie van zijn test in het lab, vergeleek Guthrie de resultaten van zijn test en van de ferricchlorideurinetest op 3.118 exemplaren van de Newark State School inNewark, New York. Vervolgens bevestigde Guthrie alle positieve gevallen die werden bepaald door de Guthrie-test en de urinetest van ijzerchloride met een kwantitatieve bloedtest. Hij vergeleek de resultaten van de Guthrie-test met de resultaten van de ijzerchloride-urinetest en hun gevoeligheid voor het nauwkeurig detecteren van de ziekte. Guthrie vond dat zijn test detecteerde eenentwintig positieve gevallen van PKU die ook werden bevestigd door de kwantitatieve bloodassay, en de ijzerchloride urine test detecteerde slechts zeventien van deze gevallen, wat betekent dat de ijzerchloride urine test niet om vier gevallen van PKU te detecteren. Volgens Guthrie suggereerden die gegevens dat zijn test kon worden gebruikt om nieuwe gevallen van PKU op te sporen in bevolkingen die al zijn gescreend met behulp van de urinetest van ijzerchloride.

Guthrie verfijnde vervolgens zijn methode door de bloedinzameling gemakkelijker te maken voor artsen. Als artsen patiënten eerder diagnosticeerden, konden patiënten een eiwitbeperkt dieet implementeren voordat het aminozuur fenylalanine totoxische niveaus in het bloed steeg en onomkeerbare neurologische schade veroorzaakte.Na het aanvankelijke succes van zijn test, wijzigde Guthrie zijn bacterialinhibition assay zodat zuigelingen een paar dagen na birth.To Guthrie stelde vast of een kleine inzameling van capillair bloed uit de hiel van een kind zou werken op de bacterialinhibition assay. Hij maakte kaarten, later Guthrie kaarten genoemd, die dikkere filterpapier waren, elk met een metalen blad dat een kinderhuid doorboorde en het resulterende bloed verzamelde. Hij liet het bloed direct op de kaart drogen en bewaarde het voor testen. Van de kaart, hij vervolgens gat punch rond papieren schijf van het bloed te worden geplaatst later op de agargelcultuur. Guthrie vond dat de bacteriële inhibitietest werkte met infant ‘ s hielbloed.Na Guthrie ‘ s ontwikkeling van zijn PKU-test,begon de National Association of Retarded Citizens in New York City, NewYork, het gebruik van de Guthrie-test te ondersteunen en selecteerde twee zusters die PKU als hun poster kinderen hadden voor een poging om de test in 1961 te publiceren. De oudere zus, Sheila McGrath, had mentaalstoornissen en werd gediagnosticeerd met PKU later in het leven. De jongere zus, Kammy McGrath, werd gediagnosticeerd met PKU door de Guthrie test enbehandeld vroeg in haar leven, waardoor mentale handicaps te vermijden. In de val van 1961 publiceerde de National Association of Retarded Citizens de Guthrie test op hun persconferentie in San Francisco, Californië, en Life Magazine publiceerde een artikel over Guthrie en zijn pasgeboren scherm het volgende jaar.Ook in 1961 financierde het Amerikaanse kinderbureau inWashington, D. C. Guthrie om de Guthrie-test te testen bij 400.000 zuigelingen. Guthrie en zijn team testten 404.568 zuigelingen op PKU met behulp van de Guthrie test en de ijzerchloride urine test. Guthrie en zijn teamdiagnosticeerde 37 gevallen van PKU in twee jaar. Guthrie ’s testidentified 275 baby’ s as presumptive positive for PKU, wat betekent dat ze waarschijnlijk PKU hebben. Van de 275 kinderen die positief werden geacht voor PKU,werden zevenendertig gevallen van PKU bevestigd door de Guthrie test te herhalen en een kwantitatieve bloedtest te gebruiken, wat betekent dat de test effectief was.In 1962 sloot Guthrie een contract met Ames Company in Elkhart, Indiana,een divisie van Miles Laboratories, om Guthrie testkits te produceren en op de markt te brengen voor ziekenhuizen. Het bedrijf Ames bepaalde echter dat ze alleen een contract zouden aangaan als de test een patent zou krijgen. Guthrie diende in 1962 in eigen naam een apatent in voor de Guthrie test. Daarna tekende hij een exclusieve licentieovereenkomst met Ames Company. De licentieovereenkomst verleende Guthrie geen royalty ‘ s, wat betekent dat Guthrie geen geld zou verdienen met de verkochte testkits. Vijf procent van de netto-opbrengst van de test werd verdeeld over de National Association for Retarded CitizensResearch Fund, de Association for Aid of Crippled Children in New YorkCity, New York, en de University of Buffalo Foundation in Buffalo, NewYork. Guthrie heeft niet bepaald tegen welke prijs de kits in het contract moeten worden verkocht.Na de ondertekening van het contract worstelde Ames Company met de productie van voldoende testkits om aan de vraag te voldoen. Guthrie hielp de testkits te produceren en kreeg financiële steun van het Amerikaanse kinderbureau om kits te produceren en te assembleren om 500 tests uit te voeren in een gehuurd huis in Buffalo, New York. Guthrie ‘ s kits verkocht voor $6 per stuk. In 1963, Guthrielearn dat Ames Company van plan om $262 elk voor dezelfde pkutest kit. Volgens biograaf Jean Koch eiste Guthrie een verlaging van de prijs. Guthrie vroeg Russell B. Long, Een Amerikaanse Senator uit Louisiana, om de zaak te onderzoeken om te zien of het Ames bedrijf volledige wettelijke controle had over de prijs van de testkits.Senator Long meldde dat de US Public Health Service, een afdeling van het Amerikaanse Ministerie van gezondheid, gevestigd in Washington, DC, de Overeenkomst van Guthrie met de particuliere Ames Company niet had goedgekeurd. Twee vrijwillige gezondheidsorganisaties en het kinderziekenhuis van Buffalo hadden de overeenkomst echter gesteund, zodat het bedrijf Ames de prijs volledig onder controle had. Volgens onderzoeker Diane B. Paul, Guthrie diep betreurde het niet opnemen van een prijs bepaling in het contract. Ames Company bracht vervolgens een verklaring uit dat er geen kits werden verkocht voor $ 262 en dat duizenden dollars aan procedures werden gebruikt om de kosten van de bouwproductiefaciliteiten voor de Guthrie testkits te dekken. Het bedrijf verkocht testkits die konden testen voor 325 zuigelingen voor $67,71 per stuk.Nadat Guthrie een bedrijf had gevonden om zijn tests te vervaardigen, worstelde hij om ziekenhuizen zover te krijgen de test uit te voeren en medische tijdschriften om zijn testresultaten te publiceren. Guthrie andparents of children with PKU pushed wetgevers om newbornscreening van PKU mandaat in elke staat. In 1963 gaf Massachusetts opdracht aan newbornscreening voor PKU. Het jaar, de Guthrie publiceerde een aantal van zijn resultaten in een peer-reviewed tijdschrift. Guthrie voerde vervolgens campagne in vele staten en landen en gaf toespraken en lezingen op conferenties om regeringen aan te moedigen de Guthrie-test op te leggen. In 1966 was de Guthrie-test in de meeste staten van de Verenigde Staten bindend.

na de jaren zestig besteedden onderzoekers meer aandacht aan PKU. In 1990 kwamen wetenschappers over de hele wereld bijeen om kwesties en vorderingen in de diagnose en behandeling van PKU inParis, Frankrijk, te bespreken. Later dat jaar voerde een groep onderzoekers onder leiding van YoshiyukiOkano in Houston, Texas, een mutatieanalyse uit van het PAH-gen, dat verantwoordelijk is voor de productie van fenylalaninehydroxylase. Die groep onderzoekers creëerde ook een database voor PAHgene mutaties. De PAH-database leidde tot de documentatie van meer dan 340 genmutaties die PKU kunnen veroorzaken. Ook in de jaren 1990 ontwikkelden de Amerikaanse onderzoekers Donald Chase, David Millington, Naoto Terada, Stephen Kahler, CharlesRoe en Lindsay Hofman een nieuwe techniek om PKU te testen met behulp van Tandem massaspectrometrie. Wetenschappers gebruiken tandem massaspectrometrie om ionen te scheiden die op hun lading-aan-massaverhouding worden gebaseerd om PKU in bloedmonsters te ontdekken. Tandem massaspectrometrie, net als de originele Guthrie test, maakt gebruik van een gat-punch van gedroogd bloed. Nochtans, kan het voor een bredere verscheidenheid van aangeboren ziekten screenen gebruikend één steekproef.

in de eenentwintigste eeuw hadden alle vijftig staten ziekenhuizen nodig om pasgeborenen te testen voor PKU,en de Guthrie-test werd op veel plaatsen over de hele wereld gebruikt. Artsen in minder economisch ontwikkelde gebieden gebruikten de Guthrie-test om infants met PKU te diagnosticeren. Echter, in de eenentwintigste eeuw, veel hospitalen gebruikt tandem massaspectrometrie, die kan screenen op een grotere verscheidenheid van longziekten dan de Guthrie test. Beide methoden worden nog steeds gebruikt om het opgedroogde bloed van zuigelingen op te slaan voor tests.