1 Introductie
genen voor transmembrane proteins (TMPS) maken 20-30% van de meeste genomen uit (Wallin & Heijne, 1998), en op basis van hun kritische rol in de celfysiologie, zijn TMPs het doelwit van een grote fractie van klinisch bruikbare geneesmiddelen. Daarom is het van groot belang dat hun structuren en actiemiddelen worden vastgesteld. Het aantal beschikbare tmp-structuren met hoge resolutie blijft echter relatief laag (zie de webpagina van Stephen White; http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/). Twee verklaringen die zijn vaak ingeroepen voor de moeilijkheid van het verkrijgen van een goed diffracting kristallen van TMPs voor gebruik in de X-ray diffractie studies (1) TMPs structureel dynamisch en flexibel regio ’s die het moeilijk maken voor het eiwit tot het vaststellen van de uniforme conformatie nodig voor het verpakken in een kristal; en (2) oppervlakken van transmembraan regio’ s van TMPs niet aan zo gemakkelijk als het oppervlak van een bolvormige oplosbare eiwitten in eiwit–eiwit interacties die nodig zijn voor crystal verpakking. De introductie van een stabiel oplosbaar eiwit in een aan het oppervlak blootgesteld gebied van een TMP biedt een manier om beide problemen mogelijk te omzeilen, aangezien een dergelijke insertie op een interne locatie in een TMP de algehele flexibiliteit kan verminderen en omdat de aanwezigheid van een gemakkelijk kristallizeerbaar oplosbaar domein intermoleculaire contacten kan leveren die nodig zijn voor kristallisatie (Chun et al., 2012; Engel, Chen, & Privé, 2002).
fusie van T4-lysozym (T4L) op interne locaties in TMPs heeft tot op heden een succesvolle aanpak opgeleverd voor het bepalen van de structuren van diverse leden van de belangrijke GPCR-superfamilie (Cherezov et al., 2007; Chien et al., 2010; Dore et al., 2014; Fenalti et al., 2014; Granier et al., 2012; Haga et al., 2012; Hanson et al., 2012; Hollenstein et al., 2013; Jaakola et al., 2008; Kruse et al., 2012; Manglik et al., 2012; Rosenbaum et al., 2007, 2011; Shimamura et al., 2011; Tan et al., 2013; Wacker et al., 2013; Wang et al., 2013; White et al., 2012; Wu et al., 2010, 2012; Xu et al., 2011; Zhang et al., 2012). Soortgelijke interne fusies van een thermisch gestabiliseerde apocytochrome b (Wacker et al., 2013; Wang et al., 2013; Zhang, Zhang, Gao, Paoletta et al., 2014; Zhang, Zhang, Gao, Zhang, et al., 2014) en rubredoxin (Tan et al., 2013) hebben ook GPCR-structuren opgeleverd. Bovendien zijn verscheidene GPCR structuren verkregen door kristallisatie van constructies waarin de stabiliserende eiwitpartner bij het n-eindpunt van de receptoropeenvolging, eerder dan bij een interne positie (Fenalti et al., 2014; Rasmussen, Choi, et al., 2011; Rasmussen, DeVree, et al., 2011; Siu et al., 2013; Thompson et al., 2012; Wu et al., 2014), die suggereren dat de rol van fusieproteã nen in het vergemakkelijken van vorming van intermoleculaire contacten belangrijker kan zijn voor het bevorderen van kristallisatie dan de vermindering van tmp flexibiliteit. Alternatieve benaderingen voor het verkrijgen van GPCR-structuren die het gebruik van fusieproteïnen niet impliceren, omvatten cocrystallisatie met anti-receptorantilichamen (Kruse et al., 2013; Rasmussen, Choi, et al., 2011; Rasmussen et al., 2007; Rasmussen, DeVree, et al., 2011; Ring et al., 2013) en de kristallisatie van GPCR varianten die zijn thermostabiliseerd door de introductie van puntmutaties en deleties (Egloff et al., 2014; Scott, Kummer, Tremmel, & Pluckthun, 2013; Tate, 2012). In feite, hebben de meeste fusieproteïnebevattende GPCR varianten die voor succesvolle structuurbepaling worden gebruikt ook puntmutaties en truncations opgenomen die worden ontworpen om eiwitstabiliteit verder te verbeteren en flexibiliteit te verminderen.
insertie van stabiele oplosbare eiwitten in tmp ’s ter bevordering van kristallisatie is over het algemeen uitgevoerd als insertie of vervanging van residuen in de derde intracellulaire (IC3) lus van GPCR’ s. Dit is gebaseerd op de verwachting dat dit gebied in receptoren flexibel is en de relatieve beweging van omringende helices kan controleren (Rosenbaum et al., 2007), alsmede het verminderen van de kans dat de integratie van de fusiepartner de Algemene GPCR-structuur zal verstoren (Chun et al., 2012). Hoewel dergelijke inserties vaak de Algemene structuren van receptoren niet verstoren (gebaseerd op het behoud van ten minste enige ligandbindingsaffiniteit door de fusieconstructies), resulteren ze in het algemeen in verlies van het vermogen om het verwante trimerische g-eiwit te activeren (Rosenbaum et al., 2007), wat niet verwonderlijk is aangezien de IC3-lijn vaak de plaats van functionele interactie tussen GPCRs en de proteã nen van trimeric G is die hun directe stroomafwaartse effectoren zijn. Bovendien zijn de criteria voor het vaststellen van specifieke junctieplaatsen voor het inbrengen van fusieproteïnen en voor het bepalen van de hoeveelheid receptorsequentie die zij vervangen, niet goed vastgesteld. Een succesvolle fusie moet een optimale overeenkomst tussen het uit elkaar plaatsen en de oriëntatie van de N – en C-eindpunten van de ingevoegde proteã ne en de verbindingsplaatsen in GPCR (Chun et al., 2012; Engel et al., 2002). Zo kan het creëren van een nuttige fusie synthese of bouw van meerdere versies van gefuseerde genen vereisen (Rosenbaum et al., 2007).
we beschrijven hier een strategie voor het genereren en screenen van een bibliotheek van variant vormen van een receptor die inserties van T4L op verschillende punten in de derde intracellulaire (IC3) lus bevat als vervanging voor verschillende aantallen aminozuurresiduen in de lussequentie (Mathew, Ding, Naider, & Dumont, 2013). Door het uiten van receptoren in gist, is het mogelijk om een gerandomiseerde bibliotheken van varianten met lysozym invoegingen en om direct-scherm voor constructies met een maximale totale expressie niveaus, nummers van ligand binding sites op het celoppervlak, en zelfs receptor functie, getest op basis van de activering van de cognate G eiwit. De benaderingen waren succesvol in het identificeren van receptoren met inserties in de IC3-lijn die bijna volledige signalerende functie behouden. Dit stelt voor dat, wanneer in bijlage via aangewezen verbindende opeenvolgingen, de molecule T4L in deze lijn kan worden opgenomen zonder toegang van de proteã ne van G aan relevante oppervlakten van de geactiveerde receptor te verhinderen.
de beschreven protocollen werden ontwikkeld met behulp van Ste2p, een endogene GPCR van de gist Saccharomyces cerevisiae, gebruikt als een tracteerbaar beginsysteem waarvoor nog geen driedimensionale structuur beschikbaar is. Nochtans, zouden de gelijkaardige benaderingen kunnen worden gebruikt om insertie-bevattende varianten van de talrijke zoogdiergpcrs te identificeren die om de weg van de gistferomoonrespons kunnen activeren (Brown et al., 2000; Dowell & Brown, 2009; King, Dohlman, Thorner, Caron, & Lefkowitz, 1990; Pausch, 1997), or to other TMPs for which it is possible to assay for function in intacte cells. Bovendien zijn gistsoorten gebruikt als expressiesystemen voor structuurbepaling van GPCR ’s en andere tmp’ s (Clark et al., 2010), waaronder voor de bepaling van de kristalstructuur van de humane H1 histamine receptor (Shimamura et al., 2011; Shiroishi et al., 2011). Ste2p is de receptor voor de gistpaarferomoon-α-factor, een 13-residupeptide. De band van dit ligand resulteert in activering van een cytoplasmic heterotrimeric proteã ne G, die, beurtelings, een weg van het KAARTKINASE activeert, uiteindelijk leidend tot transcriptional reacties, veranderingen in celvorm, de arrestatie van de celcyclus, en fusie met gistcellen van het tegenovergestelde het koppelen type.