2-D de elektroforese begint met elektroforese in de eerste dimensie en scheidt dan de molecules loodrecht van de eerste om een elektroferogram in de tweede dimensie te creëren. In elektroforese in de eerste dimensie, worden de molecules lineair gescheiden volgens hun iso-elektrisch punt. In de tweede dimensie, worden de molecules dan gescheiden bij 90 graden van het eerste elektroferogram volgens moleculaire massa. Aangezien het onwaarschijnlijk is dat twee molecules in twee verschillende eigenschappen gelijkaardig zullen zijn, worden de molecules effectiever gescheiden in 2-D elektroforese dan in 1-D elektroforese.
de twee dimensies waarin eiwitten worden gescheiden met behulp van deze techniek kunnen iso-elektrisch punt, eiwitcomplex massa in de oorspronkelijke staat of eiwitmassa zijn.
scheiding van de eiwitten door iso-elektrisch punt wordt iso-elektrische focussering (IEF) genoemd. Daarbij wordt een pH-gradiënt toegepast op een gel en wordt een elektrisch potentieel toegepast over het gel, waardoor het ene eind positiever is dan het andere. Bij alle pH-waarden buiten hun iso-elektrisch punt, worden eiwitten geladen. Als ze positief geladen zijn, zullen ze naar het meer negatieve uiteinde van de gel worden getrokken en als ze negatief geladen zijn, zullen ze naar het meer positieve uiteinde van de gel worden getrokken. De proteã nen die in de eerste dimensie worden toegepast zullen langs de gel bewegen en zullen zich op hun iso-elektrisch punt ophopen; dat wil zeggen, het punt waarop de totale lading op de proteã ne 0 is (een neutrale lading).
voor de analyse van de werking van eiwitten in een cel is kennis van hun samenwerking essentieel. Meestal werken eiwitten samen in complexen om volledig functioneel te zijn. De analyse van deze suborganelle organisatie van de cel vereist technieken die de inheemse staat van de eiwitcomplexen bewaren. In inheemse polyacrylamidegelelektroforese (inheemse pagina), blijven de proteã nen in hun inheemse staat en worden gescheiden in het elektrische veld na hun massa en de massa van hun complexen respectievelijk. Om een scheiding te verkrijgen door grootte en niet door netto lading, zoals in IEF, wordt een extra lading overgebracht naar de proteã nen door het gebruik van Coomassie briljant blauw of lithiumdodecylsulfaat. Na voltooiing van de eerste dimensie worden de complexen vernietigd door toepassing van de denaturerende SDS-pagina in de tweede dimensie, waar de eiwitten waaruit de complexen zijn samengesteld worden gescheiden door hun massa.
voordat de eiwitten in massa worden gescheiden, worden ze behandeld met natriumdodecylsulfaat (SDS) samen met andere reagentia (SDS-PAGE in 1-D). Dit denatureert de proteã nen (dat wil zeggen, het ontvouwt hen in lange, rechte molecules) en bindt een aantal SDS molecules ruwweg evenredig aan de lengte van de proteã ne. Omdat de lengte van een eiwit (wanneer uitgevouwen) ruwweg evenredig is aan zijn massa, is dit gelijk aan te zeggen dat het een aantal SDS-moleculen ruwweg evenredig aan de massa van het eiwit hecht. Aangezien de molecules van SDS negatief geladen zijn, is het resultaat hiervan dat alle proteã nen ongeveer dezelfde massa-aan-lastverhouding als elkaar zullen hebben. Daarnaast zijn eiwitten zal niet migreren als ze geen last (een resultaat van de izoelektricheskoi focussen stap) daarom is de coating van het eiwit in SDS (negatief geladen) kan de migratie van de eiwitten in de tweede dimensie (SDS-PAGE, is het niet geschikt voor gebruik in de eerste dimensie is gebracht en een niet-ionische of zwitterionic wasmiddel gebruikt moet worden).In de tweede dimensie, een elektrische potentiaal is opnieuw toegepast, maar in een hoek van 90 graden van het eerste veld. De proteã nen zullen naar de meer positieve kant van het gel worden aangetrokken (omdat SDS negatief geladen is) evenredig aan hun massa-aan-lastverhouding. Zoals eerder uitgelegd, zal deze verhouding bijna hetzelfde voor alle proteã nen zijn. De vooruitgang van de eiwitten zal worden vertraagd door wrijvingskrachten. Het gel handelt daarom als een moleculaire zeef wanneer de stroom wordt toegepast, scheidend de proteã nen op basis van hun molecuulgewicht met grotere proteã nen die hoger in het gel worden vastgehouden en kleinere proteã nen die door de zeef kunnen overgaan en lagere gebieden van het gel bereiken.