1 Wprowadzenie
geny białek transmembrane (TMPS) stanowią 20-30% większości genomów (Wallin & Heijne, 1998) i opierając się na ich krytycznej roli w fizjologii komórki, TMPs są celami dużej części klinicznie użytecznych leków. Tak więc określenie ich struktur i sposobów działania ma duże znaczenie. Jednak liczba dostępnych struktur TMP o wysokiej rozdzielczości pozostaje stosunkowo niska (patrz strona internetowa Stephena White ’ a; http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/). Dwa wyjaśnienia, które są często przywoływane dla trudności uzyskania dobrze dyfrakcyjnych kryształów TMPs do stosowania w badaniach dyfrakcji rentgenowskiej, to (1) TMPs są strukturalnie dynamiczne z elastycznymi regionami, które utrudniają białkowi przyjęcie jednolitej konformacji wymaganej do pakowania w Kryształ; oraz (2) powierzchnie regionów transbłonowych TMPS nie uczestniczą tak łatwo, jak powierzchnie globularnych rozpuszczalnych białek w interakcjach białko–białko, które są wymagane do pakowania kryształów. Wprowadzenie stabilnego rozpuszczalnego białka do odsłoniętego powierzchniowo obszaru tmp zapewnia sposób na potencjalne obejście obu tych problemów, ponieważ takie wstawianie w wewnętrznej lokalizacji w TMP może zmniejszyć ogólną elastyczność, a obecność łatwo krystalizowalnej rozpuszczalnej domeny może zapewnić kontakty międzycząsteczkowe wymagane do krystalizacji (Chun et al., 2012; Engel, Chen, & Privé, 2002).
fuzja lizozymu T4 (T4L) w wewnętrznych lokalizacjach w TMPs do tej pory zapewniła skuteczne podejście do określania struktur różnych członków ważnej nadrodziny GPCR (Cherezov et al., 2007; Chien et al., 2010; Dore et al., 2014; Fenalti et al., 2014; Granier et al., 2012; Haga et al., 2012; Hanson et al., 2012; Hollenstein et al., 2013; Jaakola et al., 2008; Kruse et al., 2012; Manglik et al., 2012; Rosenbaum et al., 2007, 2011; Shimamura et al., 2011; Tan et al., 2013; Wacker et al., 2013; Wang et al., 2013; White et al., 2012; Wu et al., 2010, 2012; Xu i in., 2011; Zhang et al., 2012). Podobne wewnętrzne Fuzje stabilizowanego termicznie apocytochromu b (Wacker et al., 2013; Wang et al., 2013; Zhang, Zhang, Gao, Paoletta et al., 2014; Zhang, Zhang, Gao, Zhang, et al., 2014) i rubredoksyna (Tan et al., 2013) powstały również struktury GPCR. Ponadto, kilka struktur GPCR uzyskano przez krystalizację konstruktów, w których stabilizujący partner białkowy został skondensowany na N-końcu sekwencji receptora, a nie w pozycji wewnętrznej (Fenalti i wsp ., 2014; Rasmussen, Choi, et al., 2011; Rasmussen, DeVree, et al., 2011; Siu et al., 2013; Thompson et al., 2012; Wu et al., 2014), sugerując, że rola białek fuzyjnych w ułatwianiu tworzenia kontaktów międzycząsteczkowych może być ważniejsza dla promowania krystalizacji niż zmniejszenie elastyczności TMP. Alternatywne podejścia do uzyskiwania struktur GPCR, które nie obejmują stosowania białek fuzyjnych, obejmowały kokrystalizację przeciwciałami przeciw receptorowym (Kruse i wsp ., 2013; Rasmussen, Choi, et al., 2011; Rasmussen et al., 2007; Rasmussen, DeVree, et al., 2011; Ring et al., 2013) i krystalizacji wariantów GPCR, które zostały termostabilne przez wprowadzenie mutacji punktowych i delecji (Egloff et al., 2014; Scott, Kummer, Tremmel, & Pluckthun, 2013; Tate, 2012). W rzeczywistości większość wariantów GPCR zawierających białko fuzyjne stosowanych do skutecznego oznaczania struktury zawiera również mutacje punktowe i skrócenia mające na celu dalsze zwiększenie stabilności białka i zmniejszenie elastyczności.
Wstawianie stabilnych rozpuszczalnych białek do TMPs w celu promowania krystalizacji było zazwyczaj wykonywane jako wstawianie lub zastępowanie reszt w trzeciej wewnątrzkomórkowej pętli GPCRs (IC3). Opiera się to na oczekiwaniu, że ten region w receptorach jest elastyczny i może kontrolować względny ruch otaczających Helis (Rosenbaum et al., 2007), jak również zmniejszenie prawdopodobieństwa, że wprowadzenie partnera fuzyjnego zakłóci ogólną strukturę GPCR (Chun et al., 2012). Podczas gdy takie insercje często nie zakłócają ogólnych struktur receptorów (w oparciu o zachowanie przynajmniej pewnego powinowactwa wiązania ligandu przez konstrukty fuzyjne), na ogół powodują utratę zdolności do aktywacji poznanego trimerycznego białka G (Rosenbaum i in., 2007), co nie jest zaskakujące, ponieważ pętla IC3 jest często miejscem funkcjonalnych interakcji między GPCR i trimerycznymi białkami G, które są ich bezpośrednimi następcami. Ponadto kryteria ustalania poszczególnych miejsc przyłączeniowych do wstawiania białek fuzyjnych i określania ilości sekwencji receptorów, które zastępują, nie są dobrze ustalone. Pomyślna fuzja musi zapewnić optymalne dopasowanie między odstępem i orientacją N-I C-końca wstawionego białka i miejsc połączeń w GPCR (Chun et al., 2012; Engel et al., 2002). Tak więc stworzenie użytecznej fuzji może wymagać syntezy lub budowy wielu wersji skondensowanych genów (Rosenbaum et al., 2007).
opisujemy tutaj strategię generowania i przesiewania biblioteki wariantowych form receptora zawierającego insercje T4L w różnych punktach trzeciej pętli wewnątrzkomórkowej (IC3) jako zastąpienie różnych liczb reszt aminokwasowych w sekwencji pętli (Mathew, Ding, Naider, & Dumont, 2013). Poprzez ekspresję receptorów w drożdżach, możliwe jest tworzenie randomizowanych bibliotek wariantów z insercjami lizozymu i bezpośrednie przesiewanie konstruktów z maksymalnymi ogólnymi poziomami ekspresji, liczbą miejsc wiązania ligandów na powierzchni komórki, a nawet funkcją receptora, ocenianą na podstawie aktywacji poznanego białka G. Podejścia były skuteczne w identyfikacji receptorów z wstawkami w pętli IC3, które zachowują prawie pełną funkcję sygnalizacji. Sugeruje to, że po przyłączeniu za pomocą odpowiednich sekwencji łączących, cząsteczka T4L może zostać wprowadzona do tej pętli bez uniemożliwienia dostępu białka G do odpowiednich powierzchni aktywowanego receptora.
opisane protokoły zostały opracowane przy użyciu Ste2p, endogennego GPCR drożdży Saccharomyces cerevisiae stosowanych jako tractable początkowy system, dla którego nie jest jeszcze dostępna trójwymiarowa struktura. Jednak podobne podejścia można wykorzystać do identyfikacji wariantów zawierających insercję licznych GPCR ssaków, które zostały zgłoszone jako zdolne do aktywacji szlaku reakcji feromonów drożdży(Brown i wsp ., 2000; Dowell & Brown, 2009; King, Dohlman, Thorner, Caron, & Lefkowitz, 1990; Pausch, 1997), lub do innych TMPs, dla których możliwe jest oznaczenie funkcji w nienaruszonych komórkach. Ponadto gatunki drożdży zostały wykorzystane jako systemy ekspresji do oznaczania struktury GPCRs i innych TMPs (Clark et al., 2010), w tym do oznaczania struktury krystalicznej ludzkiego receptora histaminowego H1 (Shimamura i wsp., 2011; Shiroishi et al., 2011). Ste2p jest receptorem dla czynnika α feromonu współpracującego z drożdżami, peptydu 13-reszty. Wiązanie tego ligandu powoduje aktywację cytoplazmatycznego heterotrimerycznego białka G, które z kolei aktywuje szlak kinazy MAP, ostatecznie prowadząc do odpowiedzi transkrypcyjnych, zmian w kształcie komórki, zatrzymania cyklu komórkowego i fuzji z komórkami drożdży przeciwnego typu kojarzenia.