Chromatografia filtracyjna w żelu

chromatografia filtracyjna w żelu zastosowania

chromatografia filtracyjna w żelu, Rodzaj chromatografii wykluczającej wielkość, może być stosowana do frakcjonowania cząsteczek i kompleksów w próbce na frakcje o określonym zakresie wielkości, w celu usunięcia wszystkich cząsteczek większych niż określony rozmiar z próbki lub kombinacji obu operacji. Chromatografia filtracyjna w żelu może być stosowana do oddzielania związków, takich jak małe cząsteczki, białka, kompleksy białkowe, polisacharydy i kwasy nukleinowe w roztworze wodnym. Gdy rozpuszczalnik organiczny jest używany jako faza mobilna, Proces jest zamiast tego określany jako chromatografia przenikania żelu.

chromatografia filtracyjna w żelu może być również stosowana do:

• frakcjonowanie cząsteczek i kompleksów w określonym zakresie wielkości
• analiza i oznaczanie wielkości
• usuwanie dużych białek i kompleksów
• wymiana buforowa
• Odsalanie
• usuwanie małych cząsteczek, takich jak nukleotydy, startery, barwniki i zanieczyszczenia
• ocena czystości próbki
• oddzielenie wiązanych od niezwiązanych radioizotopów

żelowe środki do chromatografii filtracyjnej do wszystkich powyższych zastosowań są dostępne w pakowanych kolumnach przepływu grawitacyjnego, kolumnach wirujących, niskociśnieniowych i kolumny do chromatografii średniociśnieniowej i żywice butelkowane.

Mechanizm chromatografii filtracyjnej w żelu

w kolumnie chromatografii filtracyjnej w żelu Faza stacjonarna składa się z porowatej matrycy, a faza ruchoma jest buforem przepływającym pomiędzy kulkami matrycy. Kulki mają określony zakres wielkości porów, znany jako zakres frakcjonowania. Cząsteczki i kompleksy, które są zbyt duże, aby wejść do porów, pozostają w fazie ruchomej i poruszają się przez kolumnę z przepływem bufora. Mniejsze cząsteczki i kompleksy, które są w stanie poruszać się w porach, wchodzą w fazę stacjonarną i poruszają się przez kolumnę filtracji żelowej dłuższą ścieżką przez pory kulek.

każda cząsteczka lub kompleks, który znajduje się powyżej zakresu frakcjonowania dla konkretnej kolumny chromatografii filtracyjnej żelowej, będzie poruszać się przez kolumnę szybciej niż jakakolwiek cząsteczka, która może wejść w fazę stacjonarną. Dlatego każdy składnik w próbce, który znajduje się powyżej zakresu frakcjonowania, wymywa się najpierw (w objętości pustej) przed wszystkim, co znajduje się w zakresie frakcjonowania. Minimalny rozmiar, który pozostanie w fazie ruchomej i nie wejdzie w fazę stacjonarną, jest znany jako limit wykluczenia. Bio-Rad oferuje żelowe media do chromatografii filtracyjnej i kolumny z limitami wykluczania w zakresie trzech rzędów wielkości, od 100 Daltonów do 100 000 Daltonów (100 kDa).

cząsteczki i kompleksy, które mogą wejść w fazę stacjonarną, będą frakcjonowane zgodnie z ich rozmiarami. Mniejsze cząsteczki będą migrować w głąb porów i będą opóźnione bardziej niż większe cząsteczki, które nie tak łatwo wchodzą do porów, a tym samym są eluowane z kolumny szybciej. Ta różnica w migracji porów prowadzi do frakcjonowania składników według wielkości, przy czym największy eluting pierwszy.

w żelowych kolumnach do chromatografii filtracyjnej przeznaczonych do odsalania, wymiany buforów i usuwania małych cząsteczek, takich jak nukleotydy, Sole i małe związki łatwo dostają się do porów, są opóźnione i migrują wolniej przez kolumnę niż większe białka lub kwasy nukleinowe. W związku z tym składniki będące przedmiotem zainteresowania próbki są eluowane przed solami, nukleotydami itp. Zestawy do oczyszczania DNA wykorzystujące ten mechanizm często zawierają kolumny wirujące do filtracji żelowej.

rozdzielczość, tutaj zdefiniowana jako ostrość granic między ułamkami wielkości, jest określana przez rozmiar kulki i wiele innych czynników. Mniejszy rozmiar kulki zazwyczaj daje wyższą rozdzielczość w kolumnie chromatografii filtracyjnej w żelu. Kompaktowe cząsteczki dyfundują przez fazę stacjonarną szybciej niż cząsteczki liniowe. Wykluczenie wielkości, zakres frakcjonowania i szybkość wymywania zależą od składu bufora, siły jonowej i pH. dla frakcjonowania złożonych mieszanin białek, czasy wymywania i granice wykluczenia wielkości mogą wymagać określenia empirycznie.

żelowe Media do chromatografii filtracyjnej

ważnym kryterium dla żelowych mediów do chromatografii filtracyjnej jest to, że media są obojętne i że nic w próbce ani w żadnym buforze nie wiąże się z mediami. Inną kwestią jest rodzaj stosowanej kolumny do filtracji żelowej i to, czy jest ona stosowana w ciśnieniowym systemie chromatograficznym, czy kolumnach z przepływem grawitacyjnym lub spinowym. Jeśli stosowany jest ciśnieniowy system chromatograficzny, zarówno kolumna, jak i media muszą być w stanie tolerować stosowane ciśnienie i natężenie przepływu.

powszechnie stosowane media do chromatografii żelowej oparte są na kulkach agarozowych lub poliakrylamidowych, dekstrozie do układów grawitacyjnych lub niskociśnieniowych oraz żywicach polimerowych do układów średniociśnieniowych. Wybór mediów zależy od właściwości składników, które mają być oddzielone i innych czynników eksperymentalnych. Poniżej przedstawiono ogólne rozważania przy określaniu wyboru mediów do chromatografii filtracyjnej w żelu:

• zakres frakcjonowania
• limit wyłączenia rozmiaru
• ciśnienie robocze
• natężenie przepływu
• lepkość próbki
• zakres pH
• Autoklawowalność
• tolerancja dla wody-mieszalne rozpuszczalniki organiczne; niektóre próbki mogą być bardziej rozpuszczalne w mieszance wodno-organicznej
• tolerancja na detergenty, środki chaotropowe, formamid itp.
• temperatura pracy

rodzaje próbek, wybór mediów i konfiguracja systemu chromatograficznego określają, które parametry są najważniejsze dla danego zastosowania oczyszczania.