2-D elektroforeza rozpoczyna się od elektroforezy w pierwszym wymiarze, a następnie oddziela cząsteczki prostopadle od pierwszego, aby utworzyć elektroforezę w drugim wymiarze. W elektroforezie w pierwszym wymiarze cząsteczki są rozdzielane liniowo zgodnie z ich punktem izoelektrycznym. W drugim wymiarze cząsteczki są następnie oddzielane pod kątem 90 stopni od pierwszego elektroferogramu zgodnie z masą cząsteczkową. Ponieważ jest mało prawdopodobne, że dwie cząsteczki będą podobne w dwóch różnych właściwościach, cząsteczki są skuteczniej oddzielane w elektroforezie 2-D niż w elektroforezie 1-D.
dwa wymiary, w które białka są rozdzielane za pomocą tej techniki, mogą być punktem izoelektrycznym, masą kompleksu białkowego w stanie natywnym lub masą białkową.
rozdzielenie białek przez punkt izoelektryczny nazywa się ogniskowaniem izoelektrycznym (IEF). W ten sposób na żel nakłada się gradient pH i na żel nakłada się potencjał elektryczny, dzięki czemu jeden koniec jest bardziej dodatni niż drugi. Przy wszystkich wartościach pH innych niż ich punkt izoelektryczny, białka będą ładowane. Jeśli są dodatnio naładowane, zostaną przyciągnięte do bardziej ujemnego końca żelu, a jeśli są ujemnie naładowane, zostaną przyciągnięte do bardziej dodatniego końca żelu. Białka zastosowane w pierwszym wymiarze będą poruszać się wzdłuż żelu i będą gromadzić się w swoim punkcie izoelektrycznym; to jest punkt, w którym całkowity ładunek na białku wynosi 0 (ładunek neutralny).
do analizy funkcjonowania białek w komórce niezbędna jest znajomość ich współpracy. Najczęściej białka działają razem w kompleksach, aby były w pełni funkcjonalne. Analiza tej sub organelle organizacji komórki wymaga technik zachowania natywnego stanu kompleksów białkowych. W natywnej elektroforezie żelu poliakrylamidowego (strona natywna) białka pozostają w stanie natywnym i są rozdzielane w polu elektrycznym odpowiednio po ich masie i masie ich kompleksów. Aby uzyskać oddzielenie według wielkości, a nie według ładunku netto, jak w IEF, dodatkowy ładunek jest przenoszony na białka za pomocą błękitu brylantowego coomassie lub siarczanu dodecylu litu. Po zakończeniu pierwszego wymiaru kompleksy są niszczone przez zastosowanie denaturującego SDS-PAGE w drugim wymiarze, gdzie białka, z których składają się kompleksy, są oddzielane swoją masą.
przed oddzieleniem białek masowo traktuje się je siarczanem dodecylu sodu (SDS) wraz z innymi odczynnikami (SDS-PAGE w 1-D). To denaturuje białka (to znaczy rozkłada je na długie, proste cząsteczki) i wiąże wiele cząsteczek SDS w przybliżeniu proporcjonalnych do długości białka. Ponieważ długość białka (po rozłożeniu) jest w przybliżeniu proporcjonalna do jego masy, jest to równoważne stwierdzeniu, że przyłącza ono liczbę cząsteczek SDS w przybliżeniu proporcjonalną do masy białka. Ponieważ cząsteczki SDS są naładowane ujemnie, wynikiem tego jest to, że wszystkie białka będą miały w przybliżeniu taki sam stosunek masy do ładunku jak nawzajem. Ponadto białka nie będą migrować, gdy nie mają ładunku (w wyniku etapu ogniskowania izoelektrycznego), dlatego powłoka białka w SDS (ujemnie naładowanym) umożliwia migrację białek w drugim wymiarze (SDS-PAGE, nie jest kompatybilna do stosowania w pierwszym wymiarze, ponieważ jest naładowana i należy użyć niejonowego lub zwitterionowego detergentu). w drugim wymiarze ponownie stosuje się potencjał elektryczny, ale pod kątem 90 stopni od pierwszego pola. Białka będą przyciągane do bardziej pozytywnej strony żelu (ponieważ SDS jest naładowany ujemnie) proporcjonalnie do ich stosunku masy do ładunku. Jak wcześniej wyjaśniono, stosunek ten będzie prawie taki sam dla wszystkich białek. Postęp białek zostanie spowolniony przez siły tarcia. Dlatego żel działa jak sito molekularne, gdy prąd jest przyłożony, oddzielając białka na podstawie ich masy cząsteczkowej, przy czym większe białka są zatrzymywane wyżej w żelu, a mniejsze białka są w stanie przejść przez sito i dotrzeć do niższych regionów żelu.