2 myszy transgeniczne R6/2
linia R6 została opracowana w laboratoriach Gill Bates z pronuklearnego wstrzyknięcia fragmentu Sacl-EcoRI o rozmiarze 1,9 kb przy użyciu 5′ końca ludzkiego genu HD pochodzącego od pacjenta HD. Składa się z ∼1 kb sekwencji 5′ UTR, eksonu 1 z powtórzeniami CAG wynoszącymi ∼130 jednostek i pierwszych 262 bp intronu 1. Linia R6 / 2 była pierwszym transgenicznym mysim modelem HD. Ma wielkość piku 144-150 powtórzeń w eksonie 1 (Mangiarini et al., 1996). Jest to jeden z najczęściej wykorzystywanych modeli genetycznych HD. Model R6 / 2 wykazuje progresywny, homogeniczny fenotyp HD, przeżywalność wynosi od 14 do 21 tygodni, w zależności od warunków w domu i Ośrodku. Różnice w czasie przeżycia mogą być wynikiem różnic w zakresie warunków przechowywania, obchodzenia się z nimi, wzbogacania środowiska oraz dopuszczalnej obecności symbiontów wirusowych i bakteryjnych, oprócz innych czynników. Biorąc pod uwagę, że wzbogacone środowiska mogą zmieniać progresję fenotypu behawioralnego u myszy R6/2 (Hannan, 2004), wydaje się, że różnice między laboratoriami mogą również zmieniać fenotyp R6/2. Myszy R6 / 2 obecnie dostępne w komercyjnym vivaria mają znacznie mniejszą liczbę powtórzeń CAG niż te wcześniej używane w badaniach eksperymentalnych. Powyższe kwestie dowodzą, że w obrębie każdej kolonii myszy R6 / 2 rozmiar powtórzeń CAG ma kluczowe znaczenie dla wszelkich wyników, a powtarzalny pomiar przeżycia i inne miary fenotypowe są nadrzędne dla każdego kolejnego pokolenia „f” w porównaniu z innymi badaniami.
analizy behawioralne zaburzeń związanych z pokazem myszy R6/2 w dystonicznych ruchach, osiągach motorycznych, sile chwytu i masie ciała, które stopniowo pogarszają się aż do śmierci. R6 / 2 myszy mają skłonność do napadów padaczkowych (stan padaczkowy) i nagłej śmierci, szczególnie w schyłkowej fazie choroby, chociaż napady mogą wystąpić już po 60 dniach. Overhandling i inne stresory zaostrzają aktywność napadową. Następstwa neuropatologiczne, które obejmują rosnące znaczne zmniejszenie masy mózgu, występują od 30 dni, podczas gdy zmniejszona objętość mózgu i powiększenie nadkomorowe są obecne od 60 dni, oba są znakiem rozpoznawczym ludzkiej choroby. Ponadto w wieku 90 dni występuje zmniejszenie objętości neostriatalnej, zanik neuronów prążkowia, zwiększona astroglioza i zmniejszenie liczby neuronów prążkowia(Stack i in., 2005). Ponadto, zgodnie z wczesnym początkiem HD u dorosłych, neurony prążkowia enkefaliny są zredukowane w porównaniu z neuronami projekcyjnymi prążkowia substancji-P (Sun et al., 2002) z równym zachowaniem enkefaliny i substancji-P striatonigral projekcje. Agregaty dodatnie huntingtyny są obecne w 1. dniu po urodzeniu i zwiększają się wraz z wiekiem, co sugeruje, że początek i progresja choroby występują przed występowaniem zjawisk klinicznych (Stack i in., 2005). Inkluzje huntingtyny są rozległe i występują w całym mózgu w ogromnych ilościach, co jest zjawiskiem niespójnym z obserwowanym u pacjentów HD. Sugerowano, że ten ostatni może być wynikiem użycia tylko części genu HD, efektów transgenu i/lub użycia zagranicznych promotorów, które zwiększają poziom ekspresji. Wydaje się, że nie ma żadnych różnic płciowych w fenotypie patologicznym. Istnieje równoległość między opisywanymi mechanizmami patogenezy choroby obserwowanymi u pacjentów HD A mechanizmami obserwowanymi u myszy R6 / 2, które obejmują zmienioną proteolizę i aktywność proteosomalną, zwiększone sieciowanie białek, indukowaną ekspresję białek opiekuńczych i defekty ważnych procesów komórkowych, które obejmują endocytozę, przemyt wewnątrzturonalny, regulację transkrypcji, sygnalizację postsynaptyczną, kaskady apoptotyczne i zmiany w metabolizmie bioenergetycznym i funkcji mitochondriów (Beal and Ferrante, 2004; Ryu et al., 2005; Stack i Ferrante, 2007). Chociaż model R6 / 2 ma wiele cech klinicznych i neuropatologicznych obserwowanych u pacjentów HD, nie jest to dokładne dopasowanie genetyczne i neuropatologiczne z pacjentami HD. Niemniej jednak model R6/2 ma dobrze scharakteryzowany fenotyp progresywny z umiarkowaną zmiennością, tak że grupy eksperymentalne mogą zawierać zaledwie 10 myszy i zapewnić moc wykrywania różnic w wielu miarach wyników. Możliwe jest przeprowadzenie badań przeżycia, ważnego potencjalnego wskaźnika zastępczego dla neuroprotekcji, w ciągu około 3 miesięcy od urodzenia. Skuteczność i wyraźne eksperymentalne punkty końcowe myszy R6/2 pozostają główną zaletą.
istnieje duża zmienność w prezentacji fenotypu, która zależy od wielkości powtórzeń CAG. Liczba powtórzeń CAG w linii R6 / 2 wynosi 148-153 przy 500-550 bp, zgodnie z analizą PCR (Stack et al., 2005). Zwiększona liczba par zasad > 550 powoduje umiarkowanie nasilenia fenotypu R6/2. Wraz ze wzrostem liczby par podstawowych dochodzi do wzrostu liczby powtórzeń CAG. Pary zasad w zakresie od 600 do 800 mają rozmiary powtórzeń CAG między 175 a 192 u myszy R6/2, a średnie wydłużenie przeżycia znacznie wzrasta do około 131 dni, w przeciwieństwie do 500-550 bp w 98 dniach. Liczby par podstawowych 1000 i powyżej mają rozmiary powtórzeń CAG stale powyżej 200, ze średnim przeżyciem 148 dni. Zmienność przeżycia i poprawa fenotypu behawioralnego i neuropatologicznego u myszy R6 / 2 o zwiększonej liczbie par zasad i rozmiarze powtórzeń CAG może zmniejszyć ich użyteczność w badaniach terapeutycznych i może zakłócać wyniki eksperymentalne (Stack i in., 2005). Chociaż duża zmienność w pomiarach klinicznych jest powszechna w badaniach na ludziach, minimalizacja zmienności pomiarów zwiększa zdolność wykrywania różnic, szczególnie w badaniach na myszach. Tak więc laboratoria wykorzystujące te myszy powinny zapewnić zmniejszenie zmienności genetycznej, zapewniając stosunkowo jednorodną populację myszy w ramach kohort doświadczalnych.