wyniki i dyskusja
analiza PCR-RFLP ujawniła wzorce restrykcyjne zgodne z analizą in silico. Wszystkie psy z malformacją ogona przedstawiały ten sam wzór (3 fragmenty, 2 widoczne pasma), który różnił się od tego przedstawianego przez psy z normalnym ogonem (2 fragmenty, 1 widoczna taśma) (rys.1). Inny test, również oparty na PCR-RFLP, był z powodzeniem stosowany do identyfikacji tej samej mutacji w genie t u psów, ale przy użyciu systemu elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (Gruszczyńska & Czapla 2011). Wykonanie elektroforezy w żelu poliakrylamidowym może poprawić rozdzielczość pasm w stosunku do fragmentów DNA w niniejszym badaniu. Jednak praktyczność zostanie zmniejszona, ponieważ system ten jest bardziej pracochłonny. W niniejszym badaniu, mimo że nie było możliwe zwizualizowanie wszystkich fragmentów DNA wygenerowanych po trawieniu, możliwe było łatwe rozróżnienie genotypów za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym.
Fig.1. PCR-RFLP do wykrywania mutacji C189G. Marker par bazowych (M), dotkniętych psów-krótki ogon (1-7) i zwierzę z normalnym ogonem (8).
w analizie próbek sekwencjonowanych heterozygotyczność C (cytozyna) G (guanina) obserwowano w nukleotydzie 189 eksonu 1 tylko u psów z wadami rozwojowymi ogona. Lokalizację mutacji oparto na sekwencji mRNA genu t dostępnej w Genbanku (numer identyfikacyjny: AJ245513).
w analizie in silico zaobserwowano również zmianę aminokwasu 63 Z izoleucyny na metioninę. Wszystkie sekwencje DNA uzyskane w niniejszym badaniu zdeponowano w Genbank pod numerami akcesyjnymi: mf495488 (krótki ogon), mf495489 (brak ogona), mf495490 (brak ogona) i mf495491 (normalny ogon).
chociaż znaleziono tylko jeden genotyp dla obecnego stanu (CG dla zwierząt z wadą ogona), zaobserwowano zmienność fenotypową u dotkniętych psów, która jest wielkością ogona. Niektóre zwierzęta prezentowały krótki ogon (około 3-4 kręgi), a inne wykazywały brak ogona (około 1-2 kręgi) (rys.2). Podobne fenotypy zaobserwowali również Haworth i wsp. (2001) in dogs. Chociaż wyjaśnienie tego nie jest jeszcze znane u psów, Buckingham et al. (2013), badając wrodzoną zmienność wielkości ogona u kotów, znaleziono dowody haploinsufficiency spowodowane wieloma mutacjami w genie T. Mutacje C. 1199delc, c.1169delc i c.998delt były związane z różnymi poziomami ekspresji genów, co mogłoby wyjaśnić różne fenotypy u psów z wadą ogona(Buckingham et al. 2013).
Fig.2. A) pies posiadający mutację c189g w genie T. B) pies z tego samego miotu bez mutacji C189G.
dziedziczny charakter mutacji może być potwierdzony przez Analizę heredogramu (Fig.3) badanego miotu. Udało się zweryfikować, czy mutacja ma autosomalny dominujący wzór dziedziczenia. Jednak w niniejszym badaniu nie stwierdzono dominującego genotypu homozygotycznego (GG), wzmacniając obserwacje, że gdy w homozygozie zmutowany gen T powoduje śmierć płodu (Haworth et al. 2001). Hytonen et al. (2009) zaobserwował, że mioty z krzyżówek między zwierzętami o normalnym ogonie (genotyp CC) były o 29% większe niż mioty z krzyżowania między zniekształconymi zwierzętami ogonowymi (genotyp CG). Wynik ten jest zgodny z oczekiwaną redukcją o 25% u potomstwa z krzyżówek zawierających allele śmiertelne.
Fig.3. Heredogram pokazujący wzór dziedziczenia mutacji c189g w genie T Labrador Retriever. Krzyżowanie między dziadkami ze strony matki (I), miot chorego psa i jego krzyżowanie z normalnym samcem (II) oraz miot badany (III).
mutacje w genie T były związane z malformacją ogona u innych gatunków, takich jak myszy i koty (Wilson et al. 1995, Buckingham et al. 2013). W niektórych z nich obserwuje się również inne zmiany, takie jak nietrzymanie moczu i kału u kotów (Robinson 1993). Jednak u psów, do tej pory, tylko wada ogona zaobserwowano u zwierząt heterozygotycznych (CG) (Indrebo et al. 2008). Chociaż w niektórych ras psów fenotyp „tail malformation” nie był związany z mutacją C189G (Boston Terrier, Buldog angielski, King Charles Spaniel, Sznaucer miniaturowy, Parson Russell Terrier i Rottweiler), duża liczba ras dotkniętych sugeruje starożytną mutację (Hytonen et al. 2009), występując u psów przodków przed powstaniem wielu ras. Jednak krzyżowanie Międzyrasowe może również przyczynić się do dyfuzji mutacji, ponieważ heterozygotyczne zwierzęta CG wydają się nie mieć libido ani zmian wydajności reprodukcyjnej. Innym czynnikiem, który może przyczynić się do dyfuzji mutacji było zastosowanie w reprodukcji psów bez ogona, gdy estetyczna caudektomia była nadal dozwolone. W tym okresie jest prawdopodobne, że wiele zwierząt z agenezą ogona zostało użytych jako reproduktory, ponieważ brak ogona był pożądany u niektórych ras, przyczyniając się do dyfuzji mutacji.
obecnie praktyka caudektomii (chirurgiczne usunięcie ogona) jest zabronioną procedurą w kilku krajach świata, takich jak Unia Europejska i Brazylia (Haworth et al. 2001, CFMV 2013). W niektórych krajach Unii Europejskiej, testy genetyczne w celu identyfikacji mutacji C189G w genie T są stosowane w celu sprawdzenia, czy brak ogona u niektórych ras jest pochodzenia wrodzonego lub zwierzęta przeszły nieregularny zabieg chirurgiczny. PCR-RFLP stosowany w niniejszym badaniu był prostą i dokładną techniką identyfikacji tej mutacji i mógł być użyty jako dowód do identyfikacji nielegalnej praktyki caudektomii.
ze względu na brak informacji o mutacji C189G w genie t u psów, nie ma dalszych informacji dotyczących jego związku z innymi morfologicznymi lub nawet fizjologicznymi postaciami, dlatego należy je zbadać.