Plazmidy 101: błąd użycia kodonów

podobny kod genetyczny jest używany przez większość organizmów na Ziemi, ale różne organizmy mają różne preferencje dla kodonów, których używają do kodowania określonych aminokwasów. Jest to możliwe, ponieważ w każdym kodonie znajdują się 4 bazy (A, T, C i G) oraz 3 pozycje. Istnieje zatem 64 możliwe kodony, ale tylko 20 aminokwasów i 3 kodony stop do kodowania, pozostawiając 41 kodonów nierozliczonych. Rezultatem jest redundancja; wiele kodonów koduje pojedyncze aminokwasy. Ograniczenia ewolucyjne ukształtowały, które kodony są używane preferencyjnie, w których organizmy-organizmy mają błąd użycia kodonów.

możesz znaleźć wiele tabel kodonów pokazujących, które kodony kodują, które aminokwasy (patrz przykład po prawej stronie). Dzięki tak prostym zasadom można pomyśleć, że łatwo jest wymyślić wykonalną sekwencję DNA, aby zakodować interesujący peptyd i wyprodukować ten peptyd w wybranym organizmie. Niestety, preferencje kodonów sprawiają, że nie można wybierać spośród możliwych kodonów losowo i oczekiwać, że sekwencja będzie dobrze wyrażać się w każdym organizmie.

więc jakie są ewolucyjne ograniczenia, które prowadzą do tych preferencji i co możemy z nimi zrobić? Czytaj dalej, aby się przekonać!

dlaczego organizmy mają różne błędy użycia kodonów?

przyczyny zróżnicowanych preferencji kodonów wśród organizmów nie są do końca poznane, ale niektóre możliwe przyczyny to:

1. ciśnienie metaboliczne-do wytworzenia Trna potrzebne są zasoby komórkowe, które rozpoznają różne kodony, odpowiednio modyfikują tRNA i ładują Trna odpowiednimi aminokwasami. Jeśli organizm wykorzystuje tylko podzbiór kodonów, musi jedynie wytworzyć podzbiór naładowanych tRNA i dlatego może potrzebować mniej zasobów na cały proces translacji. Na przykład, w warunkach wysokiego tempa wzrostu, E. coli preferencyjnie zwiększa produkcję Trna, które rozpoznają kodony znajdujące się w wysoce ekspresyjnych genach (Emilsson and Kurland, 1990).
2. kontrolowanie ekspresji genów za pomocą sekwencji genów – białka kodowane przez kodony o niskiej obfitości lub słabo naładowanych Trna mogą być wytwarzane w mniejszym tempie niż białka kodowane przez bardzo obfite, naładowane Trna. Na przykład Tuller et al. okazało się, że skuteczność translacji jest dobrze skorelowana z tendencją kodonową zarówno u E. coli, jak i S. cerevisiae.
3. składanie białka – jeśli białko jest kodowane przez mieszaninę kodonów z silnie i słabo naładowanymi Trna, różne regiony białka mogą być tłumaczone z różną szybkością. Rybosom będzie szybko przemieszczał się po regionach wymagających obfitego, naładowanego Trna, ale zatrzyma się w regionach wymagających niskiej obfitości, słabo naładowanego Trna. Kiedy rybosom straci, może to dać szybko przetłumaczone regiony szansę na prawidłowe złożenie. Na przykład Pechmann i Frydman odkryli, że fragmenty nieoptymalnych kodonów są związane ze specyficznymi strukturami drugorzędowymi w 10 blisko spokrewnionych szczepach drożdży.
4. adaptacja do zmieniających się warunków – organizmy często potrzebują ekspresji genów na różnych poziomach w różnych warunkach. Przy zróżnicowanym użyciu kodonu organizm może zmienić, które białka są silnie wyrażone, a które słabo wyrażone poprzez wytwarzanie i ładowanie specyficznych pul tRNA. Na przykład, Trna stosowane w genach kodujących aminokwasowe enzymy biosyntetyczne mogą być ładowane preferencyjnie podczas głodu aminokwasowego, co powoduje wyższą produkcję aminokwasowych enzymów biosyntetycznych (Dittmar et al., 2005).

jak błąd użycia kodonu wpływa na moje eksperymenty?

podczas gdy preferencje kodonów mogą być bardzo przydatne dla organizmów, mogą być problematyczne dla badaczy próbujących wyrazić białka w heterologicznych gospodarzach. Jeśli po prostu wzmocnisz interesujący gen z ludzkiego genomu, na przykład, może on nie wyrażać się w ogóle w E. coli (możesz znaleźć różne bazy danych pokazujące preferencje kodonów różnych organizmów w Internecie). Nawet jeśli gen jest tłumaczony, może nie działać prawidłowo. Jest to wynikiem niedopasowania preferencji kodonu ludzkiego i E. coli. Niektóre kodony powszechnie stosowane u ludzi nie są wcale powszechne u E. coli i odwrotnie. Podczas tłumaczenia tych kodonów rybosom może zatem zatrzymywać się w nieodpowiednich miejscach lub nie przebrnąć przez cały transkrypt, powodując produkcję odpowiednio niefunkcjonalnych białek i fragmentów białek.

rozwiązanie problemu bias użycia kodonów-optymalizacja kodonów i ekspresja alternatywnych Trna

optymalizacja kodonów

przy taniej syntezie DNA, jednym z podstawowych sposobów rozwiązania problemu wyboru kodonów jest resyntetyzacja genów w taki sposób, aby ich kodony były bardziej odpowiednie dla pożądanego gospodarza ekspresji. Jest to znane jako ” optymalizacja kodonów.”Choć w teorii jest to proste, nie jest to takie proste, jak się wydaje. Nawet w przypadku stosunkowo krótkich peptydów istnieje wiele możliwych sposobów ich kodowania, a to, co stanowi „odpowiedni” kodon, niekoniecznie jest oczywiste.

możesz pomyśleć: „nonsens! Powinienem po prostu wybrać kodon z najliczniejszą pulą naładowanych Trna w moim organizmie gospodarza dla każdego aminokwasu, który chciałbym zakodować”, ale, jak opisano powyżej, nie Każdy region białka powinien koniecznie być szybko przetłumaczony, aby wytworzyć białko, które działa prawidłowo.

możesz wtedy pomyśleć: „dobrze, upewnię się tylko, że obfitość kodonów, które wybieram dla gospodarza, pasuje do obfitości kodonów używanych w rodzimym organizmie.”Jest to prawdopodobnie lepszy pomysł i był z powodzeniem stosowany w przeszłości(Angov et al., 2008), ale jest jeszcze wiele innych funkcji do rozważenia przy projektowaniu pełnego genu. Niewyczerpujący wykaz obejmuje:

• obfitość kodonów w stosunku do obfitości poznanego tRNA
• sekwencje powtarzalne
• miejsca restrykcji
• sekwencje podatne na tworzenie struktur wtórnych w transkryptach RNA
• wpływ na transkrypcję (pamiętaj, nie chodzi tylko o tłumaczenie – np. wybór kodonu może przerwać miejsca wiązania czynnika transkrypcyjnego)

jak można sobie wyobrazić, nie jest łatwo dla ludzi, aby zrównoważyć wszystkie te czynniki na własną rękę. Na szczęście wielu badaczy stworzyło algorytmy optymalizacji kodonów i firmy zajmujące się syntezą DNA, takie jak narzędzia do optymalizacji kodonów online IDT i GenScript host. Pamiętaj, że to, że zoptymalizujesz Gen za pomocą jednego z tych narzędzi, nie musi oznaczać, że gen będzie dobrze się wyrażał. Jeśli masz dobrą ekspresję, powinieneś również funkcjonalnie przeanalizować produkowane białko, aby upewnić się, że prawidłowo się złożyło.

możesz uniknąć optymalizacji kodonu twoich genów, zamawiając plazmidy zawierające je z Addgene. Jeśli plazmid w Addgene zawiera gen, który został zoptymalizowany pod kątem kodonu dla konkretnego organizmu, to czasami (ale nie zawsze) zostanie to odnotowane w polu” mutacja ” na stronie plazmidu (patrz na przykład plazmid 87904). Ponieważ wiele plazmidów dostępnych w Addgene ma teraz Pełne Dane sekwencyjne, zalecamy bezpośrednią analizę sekwencji genów pod kątem optymalizacji kodonów i przydatności dla gospodarza ekspresji przed użyciem ich w eksperymentach.

ekspresja alternatywnych Trna

jeśli nie masz czasu lub funduszy na zsyntetyzowanie zoptymalizowanej kodonowo wersji twojego interesującego genu, możliwe jest nadekspresja niskiej obfitości Trna w Twoim gospodarzu ekspresji, a tym samym zwiększenie ich obfitości. Na przykład, komercyjne szczepy Rosetta E. coli wyrażają różne Trna, które zwykle występują w niskiej obfitości w E. coli.

zaletą wytwarzania dodatkowych Trna jest to, że można używać tego samego systemu ekspresji dla wielu różnych genów bez konieczności tworzenia nowych konstruktów. Jednak ze względu na problemy, takie jak niedopasowane szybkości translacji i potencjalny wpływ na wzrost komórek, nawet gospodarze produkujący alternatywne Trna mogą nie wyrażać wystarczających ilości białka będącego przedmiotem zainteresowania.

niezależnie od tego, jaką metodę wybierzesz, aby przezwyciężyć problemy związane z wyborem kodonów, powinieneś mieć jakąś metodę, aby upewnić się, że produkowane przez Ciebie białka działają prawidłowo. Nadekspresja może prowadzić do produkcji nierozpuszczalnych, niefunkcjonalnych kulek białka znanych jako ciała inkluzji, które na ogół segregują się z granulką komórkową podczas procedur oczyszczania. Nawet jeśli produkujesz dużą ilość białka w wybranym gospodarzu ekspresji, powinieneś wykonać test funkcjonalny, aby upewnić się, że białko nie tworzy ciałek inkluzji i prawidłowo się składa.

1. Angov, Evelina, et al. „Heterologiczna ekspresja białka jest wzmocniona przez harmonizację częstotliwości użycia kodonu genu docelowego z częstotliwościami gospodarza ekspresji.”PloS one 3.5 (2008): e2189. PubMed PMID: 18478103. PubMed Central PMCID: PMC2364656.

2. Dittmar, Kimberly A., et al. „Selective charging of tRNA isoacceptors induced by amino-acid głoding.”EMBO reports 6.2 (2005): 151-157. PubMed PMID: 15678157 PubMed Central PMCID: PMC1299251.

3. Emilsson, Valur, and Charles G. Kurland. „Growth rate dependence of transfer RNA abundance in Escherichia coli.”The EMBO journal 9.13( 1990): 4359-4366. PubMed PMID: 2265611 PubMed Central PMCID: PMC552224.

4. Gustafsson, Claes, Sridhar Govindarajan i Jeremy Minshull. „Codon bias and heterologous protein expression.”Trends in biotechnology 22.7 (2004): 346-353. PubMed PMID: 15245907.

5. Maertens, Barbara, et al. „Gene optimization mechanisms: a multi-gene study reveals a high success rate of full-length human proteins expressed in Escherichia coli.”Protein Science 19.7 (2010): 1312-1326. PubMed PMID: 20506237. PubMed Central PMCID: PMC2970903.

6. Pechmann, Sebastian i Judith Frydman. „Ewolucyjna konserwacja optymalności kodonu ujawnia ukryte sygnatury fałdowania kot.”Nature structural & molecular Biology 20.2 (2013): 237. PubMed PMID: 23262490. PubMed Central PMCID: PMC3565066.

7. Quax, Tessa EF, et al. „Tendencja kodonowa jako środek do dostrojenia ekspresji genów.”Molecular cell 59.2 (2015): 149-161. PubMed PMID: 26186290 PubMed Central PMCID: PMC4794256.

• ta recenzja stanowi świetny przegląd błędów użycia kodonów

8. Tuller, Tamir i in. „Wydajność przekładu zależy zarówno od biasu kodonu, jak i energii fałdowania.”Proceedings of the National Academy of Sciences 107.8( 2010): 3645-3650. PubMed PMID: 20133581. PubMed Central PMCID: PMC2840511.