resultados e discussão
a análise PCR-RFLP revelou padrões de restrição compatíveis com a análise sílica. Todos os cães com malformação da cauda apresentaram o mesmo padrão( 3 Fragmentos, 2 bandas visíveis), que era diferente do apresentado pelos cães com cauda normal (2 Fragmentos, 1 banda visível) (Fig.1). Outro ensaio, também baseado na PCR-RFLP, foi utilizado com sucesso para identificar a mesma mutação no gene T dos cães, mas utilizando um sistema de electroforese em gel de poliacrilamida (Gruszczynska & Czapla 2011). O desempenho da electroforese em gel de poliacrilamida pode melhorar a resolução das bandas relativas aos fragmentos de ADN no presente estudo. No entanto, a praticidade seria reduzida, uma vez que este sistema é mais trabalhoso. No presente estudo, apesar de não ter sido possível visualizar todos os fragmentos de ADN gerados após a digestão, foi possível distinguir facilmente os genotipos utilizando a electroforese em gel de agarose.
Fig.1. PCR-RFLP para detecção da mutação C189G. Marcador de pares de bases (M), cães afetados – cauda curta (1-7) e animal com cauda normal (8).
na análise de amostras sequenciadas, a heterozigosidade c (citosina) G (guanina) foi observada no nucleótido 189 de exon 1 apenas em cães com malformação da cauda. A localização da mutação baseou-se na sequência mRNA do gene T disponível no Genbank (número de adesão: AJ245513).
na análise in sílica, foi também observada Alteração do aminoácido 63 da isoleucina para metionina. Todas as sequências de DNA obtidas no presente estudo foram depositadas no Genbank sob a adesão números: MF495488 (cauda curta), MF495489 (ausência de cauda), MF495490 (ausência de cauda) e MF495491 (normal cauda).
embora apenas tenha sido encontrado um genótipo para a presente condição (CG para animais com malformação da cauda), foi observada uma variação fenotípica em cães afetados, que é o tamanho da cauda. Alguns animais apresentaram cauda curta (aproximadamente 3-4 vértebras), e outros mostraram ausência de cauda (aproximadamente 1-2 vértebras) (Fig.2). Fenótipos semelhantes também foram observados por Haworth et al. (2001) em cães. Embora uma explicação para isso ainda não seja conhecida em cães, Buckingham et al. (2013), estudando a variação congênita do tamanho da cauda em Gatos, encontrou evidência de haploinsuficiência causada por múltiplas mutações no gene T. As mutações C. 1199delC, C. 1169delC e C. 998delT foram associadas a diferentes níveis de expressão genética, o que poderia explicar os diferentes fenótipos entre cães com malformação da cauda (Buckingham et al. 2013).
Fig.2. A) cães portadores da mutação C189G no gene T. B) cães da mesma ninhada sem mutação C189G.
o carácter hereditário da mutação pode ser evidenciado pela análise hereditária (Fig.3) da ninhada estudada. Foi possível verificar que a mutação tem um padrão hereditário autossômico dominante. No entanto, não foi encontrado genótipo dominante homozigótico (GG) No presente estudo, reforçando as observações de que, quando na homozigose, o gene T mutado causa morte fetal (Haworth et al. 2001). Hytonen et al. (2009) observou que as ninhadas provenientes de cruzamentos entre animais de cauda normal (genótipo CC) eram 29% maiores do que as ninhadas provenientes de cruzamentos entre animais de cauda malformados (genótipo CG). Este resultado é compatível com a redução prevista de 25% na descendência de cruzamentos envolvendo alelos letais.
Fig.3. Heredograma mostrando o padrão hereditário da mutação C189G no gene T Do Labrador Retriever. Cruzamento entre os avós maternos (I), a ninhada do cão Afectado e a sua passagem com o macho normal (II) e a ninhada analisada (III).
mutações no gene T foram associadas a malformações na cauda noutras espécies, tais como ratinhos e gatos (Wilson et al. 1995, Buckingham et al. 2013). E em alguns deles, outras mudanças também são observadas, como incontinência urinária e fecal em Gatos (Robinson 1993). No entanto, em cães, até à data, apenas foi observada malformação da cauda em animais heterozigóticos (CG) (Indrebo et al. 2008). Apesar de que em algumas raças caninas a cauda “malformação” fenótipo não foi associada com o C189G mutação (Boston Terrier, Bulldog inglês, King Charles Spaniel, Schnauzer Miniatura, Parson Russell Terrier e Rottweiler), o grande número de raças afetadas sugere uma antiga mutação (Hytonen et al. 2009), estando presente em cães ancestrais antes da formação de muitas raças. No entanto, o cruzamento inter-racial também pode ter contribuído para a difusão da mutação, uma vez que os animais heterozigóticos CG parecem não ter libido ou alterações no desempenho reprodutivo. Outro fator que pode ter contribuído para a difusão de mutação foi o uso na reprodução de cães sem cauda, quando a caudectomia estética ainda era permitida. Neste período, É provável que muitos animais com agenese de cauda tenham sido usados como reprodutores, uma vez que a ausência de cauda foi desejável em algumas raças, contribuindo para a difusão da mutação.Atualmente, a prática da caudectomia (remoção cirúrgica da cauda) é um procedimento proibido em vários países do mundo, como os da União Europeia e do Brasil (Haworth et al. 2001, CFMV 2013). Em alguns países da União Europeia, são utilizados testes genéticos para identificar a mutação C189G no gene T para verificar se a ausência de cauda em algumas raças é de origem congênita ou se os animais foram submetidos a procedimentos cirúrgicos irregulares. A PCR-RFLP utilizada no presente estudo foi uma técnica simples e precisa para identificar esta mutação e pode ser usada como evidência para identificar a prática de caudectomia ilegal.
devido à escassez de informações sobre a mutação C189G no gene T dos cães, não há mais informações sobre a sua associação com outros caracteres morfológicos ou até fisiológicos, e portanto precisa ser investigada.